酸素反応の局所制御技術の開発

氧反应局部控制技术的开发

基本信息

批准号：
09750875
负责人：
桂進司
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

1分子の染色体DNAを末端からDNA断片を調製した上でリンカーDNAと連結し、PCR増幅と組み合わせることによりゲノムDNA解析の大幅な簡素化が期待される。この工程を実現するためには、染色体DNAのような巨大なDNA分子を操作する技術、1分子DNAの切断技術、1分子DNAのリンカーDNAへの連結技術、1分子PCR技術の各要素技術を実現していく必要がある。これらの要素技術の中で、本研究では巨大DNA分子の操作技術および1分子DNAの切断技術に焦点を絞って開発を進めてきた。巨大DNA分子を操作するにあたり、もっとも問題となるのは溶液中の流れに伴うせん断応力によるDNA分子の断片化である。DNA分子にグロビュールと呼ばれる相転移を導入することにより、巨大DNA分子でも断片化を起こすことなく操作できることを明らかにした。また、この構造は高度に凝縮した構造であるために、媒質との間で屈折率が高められると考え、レーザートラップを行ったところ、染色体DNA1分子の直接レーザートラップが可能であることが判明した。1分子DNAの切断技術としては制限酵素反応を局在化する方法が考えられる。現在までにレーザー照射により、約10μm程度の局所的な領域のみ酵素反応の至適温度を実現することにより制限酵素の活性化を局所化することが可能であることを確認した。さらに高精度の温度制御を行うことを目指して、温度により色彩が転移する液晶微粒子を用いて温度制御を行うことを試みたが、転移が不十分で計測・制御が難しいことが判明した。一方、マグネシウムイオン濃度の局所化を用いる方法に関しては、マイクロシリンジをマイクロフィーダによりドライブすることにより、界面の位置の制御が可能であることを明らかにしたが、現在までにはキャピラリー中に固定したDNA分子を対象とする制限酵素反応の局在化は確認されていない。

通过从一分子染色体DNA的末端制备DNA片段，将它们与接头DNA连接，并将其与PCR扩增相结合，预计基因组DNA分析将大大简化。为了实现这一过程，需要每一项基本技术：操纵染色体DNA等大DNA分子的技术、切割单分子DNA的技术、将单分子DNA连接到接头DNA的技术以及单分子PCR技术。意识到这一点。在这些基础技术中，这项研究的重点是操纵巨型DNA分子的技术和单分子DNA的切割技术。操纵大 DNA 分子时最大的问题是由于与溶液流动相关的剪切应力而导致 DNA 分子断裂。通过在 DNA 分子中引入一种称为小球的相变，我们发现即使是大的 DNA 分子也可以在不产生碎片的情况下进行操作。此外，由于这种结构是高度凝聚的，我们认为它与介质之间的折射率会增加，当我们进行激光捕获时，我们发现直接激光捕获一分子染色体DNA是可能的。作为切割单分子DNA的技术，可以考虑将限制酶反应局部化的方法。迄今为止，我们已经证实，通过使用激光照射在约10μm的局部区域达到酶反应的最佳温度，可以局部激活限制性酶。为了实现更精确的温度控制，我们尝试使用颜色随温度变化的液晶微粒来控制温度，但结果发现转变不充分，测量和控制也很困难。另一方面，关于使用镁离子浓度局部化的方法，已表明可以通过用微量进料器驱动微量注射器来控制界面的位置，但迄今为止，可以通过以下方式控制界面的位置：使用微型进料器驱动微型注射器的限制性内切酶反应的定位尚未得到证实。