マイクロマニピュレーションによるDNA試料調製法の研究

显微操作DNA样本制备方法研究

基本信息

批准号：
07750882
负责人：
桂進司
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07750882/
关键词：
レーザートラップ DNA 局所的反応制御キャピラリー濃度勾配

项目摘要

キャピラリー内でDNA一分子の操作を実現することにより、分子を一次元内に閉じ込めることが可能になり、また一方向に流れを起こすのが容易になる。本研究ではキャピラリー内にDNA分子を伸長・固定し、キャピラリー内でのマグネシウムイオン勾配を生成することにより、DNA分子の切断反応を局所的に制御することを目的としている。そこで、まず、DNA一分子の伸長操作を内径10〜35μm程度のキャピラリー内で行うことを試みた。DNA分子の末端を直径1μmのラテックス粒子と結合した後に、キャピラリー内部に分散させYAGレーザによりトラッピングした。キャピラリーによるレーザービームの屈折のためレーザトラッピングの効率が悪くなるものの、レーザ出力30mWの条件において内径35μm(厚さ8μm)のキャピラリー内で1μmのラテックス粒子をトラップすることが可能であった。また、キャピラリー外部から直流電圧を印加すると、DNA分子は負に帯電しているため正電極の方向に泳動され、ラテックス粒子を一端として伸長状態で固定することが可能である。内径10μmのガラス管両端に5cmの間隔で電極を配置し、これに直流電圧30Vを印加した場合、キャピラリー内部で伸長固定されDNA分子が観察された。同様な伸長固定操作は電圧を印加せずにキャピラリー内部にマイクロインジェクターにより流れを形成した場合も観察できた。以上に示すようにキャピラリー内におけるDNA分子のマイクロマニピュレーション技術は確立された。また、キャピラリーの一端からマグネシウムイオンを含む緩衝液を導入し、流れをマイクロマニピュレータにより制御することにより、キャピラリー内で階段状の濃度勾配が形成されることを蛍光物質(Magnesium Green)を用いて確認した。今後、形成されたマグネシウムイオン勾配を用いて伸長・固定されたDNAを局所的に切断することを試みる予定である。

实现对毛细管内单个 DNA 分子的操作使得将分子限制在一维内并促进在一个方向上的流动成为可能。在这项研究中，我们的目标是通过在毛细管内延长和固定DNA分子并在毛细管内产生镁离子梯度来局部控制DNA分子裂解反应。因此，我们首先尝试在内径约为 10 至 35 μm 的毛细管中拉长单个 DNA 分子。将 DNA 分子的末端与直径为 1 μm 的乳胶颗粒结合后，将它们分散在毛细管内并使用 YAG 激光捕获。尽管由于毛细管对激光束的折射导致激光捕获效率下降，但在激光输出的条件下，在内径为35μm（厚度：8μm）的毛细管中可以捕获1μm的乳胶颗粒。 30毫瓦。此外，当从毛细管外部施加直流电压时，带负电的DNA分子向正极方向移动，从而能够以乳胶粒子为一端将其固定在伸长状态。当在内径10μm的玻璃管两端以5cm间隔放置电极并施加30V的直流电压时，观察到DNA分子被拉长并固定在毛细管内。当使用显微注射器在不施加电压的情况下在毛细管内部产生流动时，也观察到类似的伸长固定操作。如上图所示，毛细管内DNA分子的显微操作技术已经建立。此外，通过从毛细管一端引入含有镁离子的缓冲溶液并用显微操作器控制流动，我们使用荧光物质（镁绿）确认了毛细管内形成了阶梯状浓度梯度。未来，我们计划利用形成的镁离子梯度来局部切割拉伸和固定的DNA。