マイクロマニピュレーションによるDNA試料調製法の研究

显微操作DNA样本制备方法研究

• 批准号: 07750882
• 负责人: 桂 進司
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Toyohashi University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07750882/
• 关键词: レーザートラップ; DNA; 局所的反応制御; キャピラリー; 濃度勾配; レーザートラップ; DNA; 局所的反応制御; キャピラリー; 濃度勾配

キャピラリー内でDNA一分子の操作を実現することにより、分子を一次元内に閉じ込めることが可能になり、また一方向に流れを起こすのが容易になる。本研究ではキャピラリー内にDNA分子を伸長・固定し、キャピラリー内でのマグネシウムイオン勾配を生成することにより、DNA分子の切断反応を局所的に制御することを目的としている。そこで、まず、DNA一分子の伸長操作を内径10〜35μm程度のキャピラリー内で行うことを試みた。DNA分子の末端を直径1μmのラテックス粒子と結合した後に、キャピラリー内部に分散させYAGレーザによりトラッピングした。キャピラリーによるレーザービームの屈折のためレーザトラッピングの効率が悪くなるものの、レーザ出力30mWの条件において内径35μm(厚さ8μm)のキャピラリー内で1μmのラテックス粒子をトラップすることが可能であった。また、キャピラリー外部から直流電圧を印加すると、DNA分子は負に帯電しているため正電極の方向に泳動され、ラテックス粒子を一端として伸長状態で固定することが可能である。内径10μmのガラス管両端に5cmの間隔で電極を配置し、これに直流電圧30Vを印加した場合、キャピラリー内部で伸長固定されDNA分子が観察された。同様な伸長固定操作は電圧を印加せずにキャピラリー内部にマイクロインジェクターにより流れを形成した場合も観察できた。以上に示すようにキャピラリー内におけるDNA分子のマイクロマニピュレーション技術は確立された。また、キャピラリーの一端からマグネシウムイオンを含む緩衝液を導入し、流れをマイクロマニピュレータにより制御することにより、キャピラリー内で階段状の濃度勾配が形成されることを蛍光物質(Magnesium Green)を用いて確認した。今後、形成されたマグネシウムイオン勾配を用いて伸長・固定されたDNAを局所的に切断することを試みる予定である。

通过意识到毛细管中单个DNA分子的操纵，可以将分子限制在一个维度内，并促进一个方向的流动。这项研究旨在通过在毛细管中扩展和固定DNA分子并在毛细管中产生镁离子梯度来局部控制DNA分子的切割反应。因此，首先，我们尝试在内径约10至35μm的毛细管中延伸一个DNA分子。 DNA分子的末端与直径为1μm的乳胶颗粒结合，然后分散在毛细管内并被YAG激光捕获。尽管毛细管引起的激光束折射是降低激光捕获的效率，但在激光输出的激光输出的状态下，可以将1μm乳胶颗粒捕获在内径35μm（8μm厚）的毛细管中。此外，当从毛细管外部施加直流电压时，DNA分子将负电荷，并且DNA分子沿正极电极的方向移动，从而使乳胶颗粒固定在细长状态下为一端。当将电极以5 cm的间隔为10μm的玻璃管的两端放置在玻璃管的两端，并将30 V的直流电压施加到此时，将电极扩展并固定在毛细管内，并观察到DNA分子。当微型注射器在不使用电压的情况下形成毛细管内部时，也可以观察到类似的扩展固定操作。如上所示，已经建立了毛细血管内DNA分子的微观渗透技术。此外，通过从毛细管的一端引入一个含有镁离子的缓冲液，通过微观手持控制流动，并使用荧光材料（镁镁）在毛细管中确认了阶梯状浓度梯度。将来，我们计划尝试使用形成的镁离子梯度在局部裂解扩展和固定的DNA。