凍結・融解法によるDNA1分子の輸送操作と反応操作

使用冷冻/解冻方法进行单个 DNA 分子的运输和反应操作

基本信息

批准号：
08750926
负责人：
桂進司
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08750926/
关键词：
DNA 制限酵素局所温度制御局所反応制御蛍光観察ゲノム解析

项目摘要

酵素反応を局所化することによる1分子DNAの切断操作はすでに実現している紫外線レーザーに代わるものとなることが期待され、同時に、この方法により得られた切断断片を対象としたリンカーDNAとの連結反応、PCR増幅と組み合わせることによりゲノムDNA解析の簡素化が期待される。本研究はレーザーによる局所温度制御を用いて酵素反応の局所化を実現することを目的としている。そのために、まず、赤外線吸収ガラス上で酵母染色体DNAをアガロースゲルに固定し、0℃付近まで冷却した。そのゲル中に制限酵素EcoRIおよびその反応バッファーを拡散させ、蛍光観察した結果、制限酵素によるDNAの切断反応は完全に抑制されていることが確認された。この試料にYAGレーザー(波長:1064nm,出力100mW)を照射したところ、レーザースポロット近傍のみの温度が酵素反応至適温度まで上昇し、その領域のみでDNAの切断が生じていることが確認された。今後、酵母染色体DNAより短いT4 DNAなどを用いて、レーザー出力と酵素反応活性化領域との相関を調べる予定である。また、この手法で調製されたDNA断片をPCR法により増幅するためには既知配列を持つリンカーDNAと連結を行う必要がある。しかし、酵素反応が活性化するバッファーが蛍光観察を阻害するために顕微鏡視野内でDNA連結反応を活性化することは困難であった。そこで、観察と連結酵素反応の活性化が両立する条件を調べた結果、DNA標識蛍光としてはYOYOを用い、反応バッファー中のマグネシウムイオン濃度を2mMまで低下させると、両立が可能であることが明らかになった。現在のところ、顕微鏡視野内におけるDNA連結反応は確認されていないが、今後、進めていく予定である。

通过定位酶促反应进行的单分子 DNA 切割操作有望取代现有的紫外激光，将其与连接反应和 PCR 扩增相结合有望简化基因组 DNA 分析。本研究的目的是利用激光进行局部温度控制来实现局部酶促反应。为此，首先将酵母染色体 DNA 固定在红外吸收玻璃上的琼脂糖凝胶上，并冷却至 0°C 左右。将限制酶EcoRI及其反应缓冲液扩散到凝胶中并观察荧光，结果证实限制酶的DNA切割反应被完全抑制。当用YAG激光（波长：1064 nm，输出100 mW）照射该样品时，仅激光孢子附近的温度升至酶反应的最佳温度，证实仅在该区域发生DNA切割。未来，我们计划使用比酵母染色体DNA更短的T4 DNA来研究激光输出和酶反应激活区域之间的相关性。此外，为了通过PCR扩增通过该方法制备的DNA片段，需要将其与具有已知序列的接头DNA连接。然而，由于激活酶反应的缓冲液会抑制荧光观察，因此很难在显微镜视野内激活DNA连接反应。因此，对连接酶反应的观察和激活兼容的条件进行了研究，结果发现，通过使用YOYO作为荧光DNA标记并降低反应缓冲液中的镁离子浓度，可以同时实现这两者。到2mM。目前，显微镜视野内的DNA连接反应尚未得到证实，但我们计划在未来继续开展这一工作。