極低温X線解析によるアドレノドキシンの機能解明

通过低温 X 射线分析阐明肾上腺素的功能

• 批准号: 05780440
• 负责人: 佐藤 孝雄
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780440/
• 关键词: アドレノドキシン

アドレノドキシン(以後AdXと称する)は、副腎皮質のミトコンドリア中に存在し、ステロイドホルモン生合成に関与している。2Fe-2Sクラスターを活性中心に持つ非ヘム鉄タンパク質で、分子量は約40K、アミノ酸残基128個、等電点は4.0±0.1である。十数年前からいくつかのグループにより結晶化が試みられてきたが、X線解析に適した高分解能を与える結晶は、いまだ得られていない。その原因としては、(1)分子がもともと、揺らいだ構造の部分を持っている。(2)結晶中で同一部位が複数個の分子間相互作用様式を取ることなどが考えられる。いずれもアミノ酸配列を変え、低温で回折強度を測定することにより克服できる。そこで、本研究では、分子生物学的手法(部位特異的突然変異)を取り入れ、電子伝達媒体として高活性を保持した、立体障害のない構造を持つ変異体(まず手始めにY82F、Y82W ミュータント)を設計し、大量発現系の構築、精製系の確立を行ない、結晶の質的改善を、そして測定温度を下げてX線回折像を得ることにより結晶の損傷の防止を目指した。精製には陰イオン交換体(DEAE)、硫安分画、ゲルろ過(セファクリルS-200HR)、強陰イオン交換体(TMAE)等を組合わせた。高純度のAdX(A_<414nm>/A_<276nm>>0.9)を単離することができた。この標品を結晶化標品とし、2M リン酸カリウムを沈殿剤としたハンギングドロップ蒸気拡散法(277K)にて、最大で約1mm長の六角柱状結晶を得ることができた。現在は、X線回折像の撮影を277Kにて行い、高分解能の反射が得られるか、またX線により受ける損傷の程度が低いかどうか検討を行っているところである。今年度はDNA組換え変異体を精製・結晶化する系が確立した。今後さらに種々の変異体を結晶化し、ルーチン解析を進め、AdX機能を明らかにする予定である。

肾上腺素（以下称为ADX）存在于肾上腺皮质的线粒体中，并参与类固醇激素的生物合成。它是一种非血红素铁蛋白，具有活性2FE-2S簇，分子量约为40K，128个氨基酸残基，以及4.0±0.1的等电点。尽管有几个小组试图结晶了十多年，但尚未获得尚未获得适合X射线分析的高分辨率。原因是（1）分子具有摇晃结构的一部分。 （2）晶体中的相同部分可能采用多个分子间相互作用模式。可以通过改变氨基酸序列并测量低温下的衍射强度来克服两者。 Therefore, in this study, we adopted molecular biological methods (site-directed mutations) and designed mutants with a structure that is not sterically hindered (first, Y82F and Y82W mutants) that retain high activity as electron transport media, constructed a large-scale expression system, established a purification system, and improved the qualitative crystals, and reduced the measured temperature to obtain X-ray diffraction images to prevent damage to the crystals.为了纯化，将阴离子交换剂（DEAE），硫酸铵馏分，凝胶过滤（Cephacryl S-200 Hr），强阴离子交换器（TMAE）等组合在一起。可以隔离高纯度ADX（a_ <414nm>/a_ <276nm >> 0.9）。该标本用作结晶标本，最大长度约为1 mm的六边形棱镜晶体可以通过使用2M磷酸钾作为沉淀物来获得最大长度约为1 mm的标本。当前，X射线衍射图像正在以277K的形式拍摄，目前正在研究是否可以获得高分辨率反射以及X射线造成的损害程度是否较低。今年，已经建立了一个系统来净化和结晶重组DNA突变体。将来，将进行各种突变体，将进行常规分析，并揭示ADX功能。