GTP駆動性小胞輸送タンパク質(Sar1p)のX線結晶解析

GTP 驱动的囊泡转运蛋白 (Sar1p) 的 X 射线晶体分析

基本信息

批准号：
10179213
负责人：
佐藤孝雄
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の標的タンパク質は、分子量21kDaのGTP結合タンパク質(以下Sarlpと称する)である。Sarlpは、真核細胞の特有の分泌経路(小胞体→ゴルジ体→分泌小胞→細胞膜)を有し、この小胞輸送という過程に関与し、主に小胞体に局在している。生合成されたタンパク質を小胞体からゴルジ体へ輸送過程で、輸送小胞の形成に必須である。また、Sarlpが輸送小胞からハズレて小胞体に戻る過程でSarlpによるGTP加水分解は重要である。本申請の到達目標は、SarlpのX線解析であるが、結晶化条件を予知する方法の開発でもある。この結晶化検索に、本質的な要因を選択するために、まず第一に、ネイティブ等電点を活用する。第二に、結晶化条件を迅速に見出すために統計学的な手法による最適化法の構築である。標的Sarlpタンパク質およびGTPアナログ結合複合体の結晶化の可能性の高い水準領域を、系統的に検索する。即ち、検索範囲を点から二次元に拡張して結晶化実験の高能率化を計る。その手順は、ステップ(1)「不完備要因配置」実験計画法の立案。ステップ(2)そのプロトコールに従って、結晶化条件を検索する実験を実施。ステップ(3)その実験結果を評価するために、動的光散乱法から得られる粒径分布等の流体力学的パラメータやX線小角散乱法よる慣性半径の利用。ステップ(4)得られたデータで、回帰・分散分析、また応答曲面解析、さらに統計的なニューラルネットワークによる最適モデルの獲得。現在、生化学的な実験施設を保有していない状況であるので、本年度は、等電点電気泳動システムといった生化学実験系の整備、ステップ(3)の動的光散乱計といった結晶化検索の前実験測定系の整備、ステップ(4)の統計学的な手法(ソフトウェアTrial runとNeural Connection)の導入により、結晶化前実験方法の確立を追及している。

本研究的目标蛋白是分子量为21 kDa的GTP结合蛋白（以下简称Sarlp）。 Sarlp具有真核细胞特有的分泌途径（内质网→高尔基体→分泌囊泡→细胞膜），参与该囊泡运输过程，并且主要定位于内质网。在将生物合成的蛋白质从内质网转运至高尔基体的过程中，转运囊泡的形成至关重要。此外，Sarlp对GTP的水解在Sarlp从转运囊泡丢失并返回内质网的过程中也很重要。该应用的目标是对 Sarlp 进行 X 射线分析，同时也是开发一种预测结晶条件的方法。对于这种结晶搜索，首先利用天然等电点来选择要素。其次，我们需要利用统计方法构建优化方法来快速找到结晶条件。对目标 Sarlp 蛋白和 GTP 类似物结合复合物的可能结晶水平区域进行了系统搜索。即搜索范围从点扩大到二维，以提高结晶实验的效率。程序是步骤(1)“不完全因子分配”实验设计。步骤(2)根据实验方案进行实验寻找结晶条件。步骤(3) 为了评估实验结果，使用流体动力学参数，例如动态光散射获得的粒度分布和小角X射线散射获得的惯性半径。步骤（4）使用获得的数据，利用回归/方差分析、响应面分析和统计神经网络获得最佳模型。目前，我们没有生化实验设备，因此本财年我们将开发等电聚焦系统等生化实验系统，并在步骤（3）中进行动态光散射仪等结晶搜索。一种预结晶实验方法，通过准备预实验测量系统并引入步骤(4)中的统计方法(软件试运行和神经连接)。