紫外線誘発DNA損傷による発癌遺伝子活性化に関する研究-化学合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的導入法によるアプローチ

紫外线诱导的 DNA 损伤导致致癌基因激活的研究——一种使用化学合成寡核苷酸进行位点特异性引入的方法

基本信息

批准号：
05152001
负责人：
大塚栄子
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05152001/
关键词：
チミンダイマー損傷DNA DNA修復 ras遺伝子 N1H3T3

项目摘要

DNAに生ずるチミンダイマー(TD)には,2種の異性体,cis-syn及びtrans-syn(以下,csTD,tsTDと略す)が存在する.これらを部位特異的にc-Ha-ras遺伝子に導入するために,ras合成遺伝子のコドン61CAAの相補鎖のTTをcsTD,tsTDとした21merを合成し,コドン49から68に対応するDNAカセットを構築した.TDを含むDNAカセットをプラスミドに組み込み,トランスフェクション用ベクターとした.このc-Ha-ras遺伝子を含むベクターをリン酸カルシウム法により,マウスN1H3T3細胞にトランスフェクションした.その結果,正常c-Ha-rasに比較して,高頻度にフォーカスを形成した.さらに,フォーカスを形成した細胞のゲノムのDNAを抽出し,PCR法と制限酵素処理を組み合わせることによりc-Ha-ras遺伝子の配列を解析した.csTDによってトランスフォームしたあるクローンでは,制限酵素切断法により分析すると,コドン61がCTAであることがわかった.また,tsTDにより変異としてはコドン61がCATとなっているものが検出された.c-Ha-ras遺伝子のホットスポットの一つである61番目Glnの部位にチミンダイマーの二つの異性体を導入することにより,チミンが損傷を起こしたことによりtransversionが起こり,Aとなることを証明した.cis-syn型では3'側のチミンの相手側にTを取り込み,trans-syn型では5'側でTを取り込んだ結果CAA(Gln)のところがCTA(Leu)およびCAT(His)となり点突然変異がアミノ酸の置換を引き起こしたことが明らかとなった.したがってDNAの損傷が,がん遺伝子の重要な箇所に起こると,がん化の引き金になることが明らかとなった.

DNA中存在两个异构体，即顺式-Syn和Trans-Syn（以下称为CSTD，TSTD）。为了将它们引入c-HA-RAS基因特定于特异性的C-HA-RAS基因，将21mer与RAS合成基因的密码子61CAA的互补链合成，并构建了与密码子49至68的DNA录音机的TT。含有TD的DNA盒子。通过磷酸钙方法将含有C-HA-RAS基因的载体转染到小鼠N1H3T3细胞中。结果，焦点比正常的C-HA-RAS更频繁。此外，提取了聚焦细胞的基因组的DNA，并通过将PCR和限制酶处理分析C-HA-RAS基因的序列。在一个由CSTD转换的克隆中，通过限制酶裂解分析，发现密码子61是CTA。此外，TSTD检测到密码子61的突变为CAT。通过在GLN位置引入两个胸腺二聚体的异构体，这是C-HA-RAS基因的热点之一，胸腺氨酸受损，导致横向。事实证明，发生离子，导致A。在顺式Syn类型中，T在3'side胸腺蛋白伴侣处被占用，在反式Syn型中，T在5'侧的the型中被占用T，导致CaA（GLN）为CTA（LEU）和CAT（His），导致点突变导致点突变，从而导致氨基酸变为氨基酸。因此，揭示了DNA损伤发生在癌基因的重要部位，这会触发癌症的发展。