チミンダイマ-除去修復機構の合成DNAによる解析

利用合成 DNA 分析胸腺嘧啶二聚体去除修复机制

基本信息

批准号：
03152001
负责人：
大塚栄子
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

T4エンドヌクレア-ゼVのX線による構造解析から推定される基質結合付近の塩基性アミノ酸を変換することにより、Arg3、Arg22、Arg26がPDグリコシラ-ゼ活性に重要な残基であることがわかった。Arg3をGlnに変えると活性が完全に消失する。また、立体的にこの近傍にあるGlu23をGlnに変えた場合にもPDグリコシラ-ゼ活性は消失する。興味深いことにGlu23をAspに変換してメチレン基を一個少くした場合にもこの活性が全くなくなることがわかった。さらに、Arg3をLysに変えた場合、Arg26をLysまたはGlnに変えた場合にはKmの増大が観察されたことから、これらの残基が基質との結合に重要であることが推定される。チミンダイマ-を一個含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、相補鎖と合わせて二本鎖を形成させ基質とした後、これらの変異体蛋白を加えて、CDスペクトルの変化を調べたところ、Glu23をGlnに変えた変異体は基質の高次構造に大きな変化を与えることがわかった。この変異体はチミンダイマ-を含まない二本鎖14merのCDスペクトルには変化を与えないことから、チミンダイマ-DNAに対する特異的結合能を有するものと思われる。つまりこの変異体は基質と結合するが触媒活性のない蛋白であり、基質との共結晶化に適したものである。次に塩基部を持たないアベ-シックサイトを一箇所含むデオキシリボヌクレオチドを合成し、変異体の二段階目のAPエンドヌクレア-ゼ活性を調べた。ほとんどの変異体は大量に用いたときには鎖を切断するがGlu23をGlnに変えたものは全く活性を示さなかった。Glu23をAspに変えると一段階目の反応は全く進行しないがアベ-シックサイトがあると、わずかにβー脱離を起こして鎖を切断することがわかった。この時に至適pHがわずかに酸性側となることを見出した。

通过在底物结合附近转换碱性氨基酸，这些氨基酸是根据T4核酸内切酶V的X射线结构分析推导的，可以发现Arg3，arg22和arg26是PD糖基酶活性的重要残基。当Arg3更改为GLN时，其活性完全消失。此外，当位于该区域附近的GLU23更改为GLN时，PD糖基酶活性就会消失。有趣的是，发现GLU23转换为ASP并将亚甲基组降低时，该活动完全损失。此外，当Arg3更改为LYS时，当Arg26更改为LYS或GLN时，观察到KM的增加，并且估计这些残基对于与底物结合很重要。合成了一个含有一种胸腺氨酸dymer-的寡脱氧核苷酸，并将其与互补链结合在一起形成双链后，将其用作底物，添加了这些突变蛋白以检查CD频谱的变化，并且发现一种将GLU23变化为GLU23的突变体会导致GLN级别的结构更高的订单变化。人们认为该突变体具有胸腺氨酸Dymer-DNA的特异性结合能力，因为它不会改变没有含有胸腺胺Dymer的胸腺胺Dymer-Dymer-DNA的双链14mer的CD光谱。换句话说，该变体是一种与底物结合但不是催化活性的蛋白质，适合与底物共结晶。接下来，合成了一个含有单个基础的环位位点的脱氧核糖核苷酸，并检查了突变体AP内核酸酶活性的第二阶段。大多数突变体在大量使用时会切割链，但是将GLU23更改为GLN的链条完全没有活性。当GLU23更改为ASP时，第一阶段反应根本不会进展，但是发现当存在Adethic位点时，会发生轻微的β-淘汰量并切断链条。目前，发现最佳pH值略有酸性。