チミンダイマ-除去修復機構の合成DNAによる解析

利用合成 DNA 分析胸腺嘧啶二聚体去除修复机制

基本信息

批准号：
03152001
负责人：
大塚栄子
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

T4エンドヌクレア-ゼVのX線による構造解析から推定される基質結合付近の塩基性アミノ酸を変換することにより、Arg3、Arg22、Arg26がPDグリコシラ-ゼ活性に重要な残基であることがわかった。Arg3をGlnに変えると活性が完全に消失する。また、立体的にこの近傍にあるGlu23をGlnに変えた場合にもPDグリコシラ-ゼ活性は消失する。興味深いことにGlu23をAspに変換してメチレン基を一個少くした場合にもこの活性が全くなくなることがわかった。さらに、Arg3をLysに変えた場合、Arg26をLysまたはGlnに変えた場合にはKmの増大が観察されたことから、これらの残基が基質との結合に重要であることが推定される。チミンダイマ-を一個含むオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成し、相補鎖と合わせて二本鎖を形成させ基質とした後、これらの変異体蛋白を加えて、CDスペクトルの変化を調べたところ、Glu23をGlnに変えた変異体は基質の高次構造に大きな変化を与えることがわかった。この変異体はチミンダイマ-を含まない二本鎖14merのCDスペクトルには変化を与えないことから、チミンダイマ-DNAに対する特異的結合能を有するものと思われる。つまりこの変異体は基質と結合するが触媒活性のない蛋白であり、基質との共結晶化に適したものである。次に塩基部を持たないアベ-シックサイトを一箇所含むデオキシリボヌクレオチドを合成し、変異体の二段階目のAPエンドヌクレア-ゼ活性を調べた。ほとんどの変異体は大量に用いたときには鎖を切断するがGlu23をGlnに変えたものは全く活性を示さなかった。Glu23をAspに変えると一段階目の反応は全く進行しないがアベ-シックサイトがあると、わずかにβー脱離を起こして鎖を切断することがわかった。この時に至適pHがわずかに酸性側となることを見出した。

通过转换底物键附近的碱性氨基酸，这是根据T4 End Nuclea-V-V-V的结构分析来估计的，已经发现Arg3，arg22和arg26是PD甘油虫活性的重要残基。将arg3更改为GLN完全消失。同样，如果附近的GLU23在三个维度上更改为GLN，则PD Glycosilla-Zero将消失。有趣的是，发现如果将GLU23转换为ASP，并且将米甲基组减少一个，则该活动将被完全消除。此外，当Arg3更改为LYS时，当Arg26更改为LYS或GLN时，已经观察到KM的增加，因此估计这些残基对于与底物结合很重要。在合成含有一个嵌合体形式的寡聚式基核苷酸与互补链结合使用后，添加了CD光谱的变化以添加这些突变蛋白，并将GLU23添加到GLN中。变化的突变体在底物的较高阶结构上具有重大变化。该突变体不会更改不包含嵌合体的两链14mer的CD频谱，因此它似乎具有针对chimindymedna的特定键能力。换句话说，该突变体是一种与底物结合但没有催化活性的蛋白质，适用于与底物的co缩放。接下来，合成了一个没有基础的Abe-Chic位点的Deosisillibonucleotide，并进行了合成，并检查了该变体的第二阶段Ap-Endnukulea-Zenity。大多数突变体在大量使用时切开链，但根本没有显示任何将GLU23更改为GLN的活性。如果将GLU23更改为ASP，则第一步中的反应根本不会进行，但是如果有Abe-Chic位点，则发现将链条略微β-Chic切断。目前，我发现最佳pH值略有酸性侧。