チミンダイマ-除去修復機構の合成遺伝子による解析

利用合成基因分析胸腺嘧啶二聚体去除和修复机制

基本信息

批准号：
02152002
负责人：
大塚栄子
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1990
资助国家：
日本
起止时间：
1990 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02152002/
关键词：
合成遺伝子チミンフォトダイマ-DNA修復酵素 DNA切断酵素

项目摘要

T4エンドヌクレア-ゼVのC末端の芳香族アミノ酸クラスタ-がチミンダイマ-を含む二本鎖DNAの結合に関与することは容易に推定されるので、この付近の変異体であるT127M、W128AW128S、Y129A、K130L、Y131Aについてin vitroおよびin vivoの活性を測定した。in vitro活性測定には通常、UV照射したpoly(dT)・poly(dA)やプラスミドが用いられるが、反応速度などを詳しく調べるために、2本鎖中にチミンフォトダイマ-を一個のみ持つ基質を合成した。鎖長10、14、18のオリゴデオキシヌクレオチドとその相補鎖を合成した。フィルタ-を用いる解離定数の測定では鎖長10の二本鎖は結合が観察されなかった。14量体と18量体の二本鎖の解離定数は1.1×10^<ー9>Mと1.2×10^<ー9>Mであった。チミンフォトダイマ-を含む一本鎖は酵素濃度を大きくすると切断されることがわかったが、アフィニティ-は約1/100と推定された。14量体と18量体二本鎖のKm値はそれぞれ19×10^<ー9>Mと9×10^<ー9>Mであり、ほとんど差はないと考えられる。変異体酵素のピリミジンダイマ-グリコシラ-ゼ活性は上記基質を用いて反応後、ピペリジン処理し、鎖切断を5'末端のリンの放射性同位元素を定量することにより観察した。Typ128をAlaに変えた場合はほとんど活性がなくSerに変えた場合には低い活性を示した。Tyr129は特に重要で、Tyr131、132はAlaに変換してもある程度の活性を示した。

很容易推测，T4核酸酶V的C端的芳族氨基酸簇参与了含有胸腺氨酸二酯的双链DNA的结合，因此在体外和体内活性是在接触性和体内活性的结合。通常使用紫外线辐照的聚（DT）和poly（da）或质粒进行体外活性测量，但是为了密切检查反应速率，合成了双链中仅有一个胸腺氨酸光二聚体的底物。合成了10、14和18及其互补链的寡脱氧核苷酸。使用过滤器时，未观察到链长10的双链。 14-mer和18-mer双链的解离常数为1.1×10^<-9> m和1.2×10^<-9> m。已经发现，含有胸腺胺光二聚合的单链被酶浓度升高，但估计亲和力约为1/100。 14-mer和18-mer双链的Km值分别为19×10^<-9> m和9×10^<-9> m，并且认为几乎没有差异。使用上面的底物通过反应观察突变酶的嘧啶DYMA-糖苷基酶活性，然后用哌啶进行处理，并通过在5'末端定量磷的放射性异位素来观察链断裂。当Typ128更改为ALA时，它的活性很小，但是当它更改为SER时，它的活性较低。 Tyr129尤其重要，Tyr131和132在转换为ALA时显示了一些活动。