毒素原性大腸菌耐熱性下剤毒素の受容体の構造と機能

产毒大肠杆菌热稳定性泻药毒素受体的结构和功能

• 批准号: 02670177
• 负责人: 平山 壽哉
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02670177/
• 关键词: 毒素原性大腸菌; 毒素受容体; レセプタ-; 下痢毒素; 耐熱性毒素

STh受容体の精製とSTh受容体遺伝子のexpression cloningを行った。(1)STh受容体の精製:300匹のラットの小腸上皮細胞から刷子縁細胞膜を調製し、0.1%Lubrol PXでSTh受容体を可溶化した。この粗STh受容体を濃縮後、Sephacryl Sー300 HRカラムクロマトを行った結果、分子量200kDaを示す画分にフォトアフィニテイラベリングでSThと結合する3種類の蛋白を検出した。還元状態でのSDSーpolyacrylamide電気泳動(SDSーPAGE)では、これら3種の蛋白の分子量は53kDa、70kDa、77kDaであった。かかるST受容体の分子量の相違は、STh受容体がいくつかのサブユニットから構成されていることを示唆していた。そこで、SDSーPAGEの泳動条件を変えてST受容体のサブユニット構造を証明した。すなわち、STh受容体をSDS存在下で加熱処理もしくは還元剤処理した後に、受容体蛋白の電気泳動位置の変化を解析し、70kDaの蛋白2分子からなるSTRー200Aおよび53kDaと77kDaの蛋白それぞれ1分子からなるSTRー200Bの分子形態を明らかにした。次に、Sephacryl Sー300カラムクロマトで得たSTh受容体画分をCon A Sepharoseカラムクロマト、さらにSTをリガンドとするアフィニティコロマトグラフィによって70kDa,77kDa,53kDaの蛋白をそれぞれ精製することに成功した。現在これらの蛋白の一次構造を解析中である。(2)ラット腸管上皮細胞よりpoly(A)mRNAを調製した。これをもとにcDNAを合成してpCDM8ベクタ-にインサ-トし、Cos7細胞でのST受容体のexpresioncloningを進めている。昨年11月、GarbersらによってST受容体遺伝子のクロ-ニングの報告がなされた。この報告ではST受容体は121kDaの単一ポリペプチドである。しかし、我々の成績では、ST受容体は2量体の分子構造であり、ふたつの成績にはST受容体の分子構造に大きな相違がある。我々のNorthern Analysisの結果は、複数の受容体の存在を示唆したmRNAを検出した。

进行了STh受体的纯化和STh受体基因的表达克隆。 (1)STh受体的纯化：取300只大鼠小肠上皮细胞制备刷状缘细胞膜，用0.1％Lubrol PX溶解STh受体。浓缩该粗制STh受体后，我们进行了Sephacryl S-300 HR柱层析，结果通过光亲和标记在分子量为200 kDa的级分中检测到了与STh结合的三种类型的蛋白质。还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)显示这三种蛋白的分子量分别为53kDa、70kDa和77kDa。 ST受体分子量的这种差异表明STh受体由几个亚基组成。因此，我们通过改变SDS-PAGE的电泳条件来展示ST受体的亚基结构。具体而言，在SDS存在下对STh受体进行热处理或用还原剂处理后，分析受体蛋白质的电泳位置的变化，得到由2分子70kDa蛋白质构成的STR-200A，以及对53kDa和77kDa各一种蛋白质进行了分析，阐明了由分子组成的STR-200B的分子形态。接下来，我们成功地纯化了通过Sephacryl S-300柱层析获得的STh受体级分，使用Con A Sepharose柱层析和使用ST作为配体的亲和层析分别纯化了70kDa、77kDa和53kDa的蛋白质。我们目前正在分析这些蛋白质的一级结构。 (2)从大鼠肠上皮细胞制备Poly(A) mRNA。在此基础上合成cDNA并插入pCDM8载体中，正在进行Cos7细胞中ST受体的表达克隆。去年11月，Garbers等人报道了ST受体基因的克隆。在本报告中，ST受体是121 kDa的单一多肽。然而，在我们的结果中，ST受体具有二聚体分子结构，两次结果之间ST受体的分子结构存在较大差异。我们的 Northern 分析结果检测到 mRNA，表明存在多种受体。

项目成果

Toshiya Hirayama et al.: "Glycoprotein receptors for a heatーstable enterotoxin(STh)produced by enterotoxigenic Escherichia coli." Microb.Pathog.(1991)

Toshiya Hirayama 等人：“产肠毒素大肠杆菌产生的热稳定肠毒素 (STh) 的糖蛋白受体。”(1991)

平山 壽哉: "新生化学実験講座第17巻 微生物実験法" 東京化学同人, (1991)

平山敏也：《新化学实验教程第17卷：微生物实验方法》东京化学同人，（1991）

Toshiya Hirayama,et al.: "Photoaffinity labeling of receptors of Escherichia coli heatーstable enterotoxin on cell membranes of rat intestine" Adv.Res.Cholera.Ralat.Diarrheas. 7. 105-112 (1990)

Toshiya Hirayama 等人：“大鼠肠道细胞膜上大肠杆菌热稳定肠毒素受体的光亲和标记”Adv.Res.Cholera.Ralat.Diarrreas.7.105-112 (1990)。

平山 壽哉: "日本臨牀 総説シリ-ズ 現代医学の焦点" 日本臨牀社, (1991)

平山敏也：《日本临床研究评论系列-现代医学的焦点》日本临床出版社，（1991）

Shinji Yamasaki,et al: "Structureーactivity relationship of Escherichia coli heatーstable enterotoxin:role of Ala residue at position 14 in toxinーreceptor interaction" Bull.Chem.Soc.Jpn.63. 2063-2070 (1990)

Shinji Yamasaki 等人：“大肠杆菌热稳定肠毒素的结构-活性关系：14 位丙氨酸残基在毒素-受体相互作用中的作用”Bull.Chem.Soc.Jpn.63 (1990)。