毒素原性大腸菌耐熱性下痢毒素の受容体とグアニレ-トシクラ-ゼ活性化機構

产毒大肠杆菌热稳定腹泻毒素受体及鸟苷酸环化酶激活机制

基本信息

批准号：
01570229
负责人：
平山壽哉
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1989
资助国家：
日本
起止时间：
1989 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

STh受容体の精製と構造解析を中心に研究を進めた。ラットの小腸上皮細胞から刷子縁細胞膜を調製し、各種の界面活性剤を用いてSTh受容体の可溶化を試みた結果、0.1%Lubrol PXがもっともSTh受容体を効率よく可溶化することがわかった。そこで、Lubrol PX処理して得られた粗STh受容体を濃縮後、Sephacryl S-300HR カラムクロマトを行った。分子量200,000を示す画分にフォトアフィニテイラベリングでSThと結合する。3種類の蛋白が検出れた。この3種の蛋白のSDS-polyacrylamide電気泳動により求まる分子量は53,000、70,000、77,000であり、ゲル濾過法によって求めた分子量の値200,000より小さく、STh受容体がいくつかのサブユニットから抗生されていることを示唆していた。ここで得たSTh受容体画分をCon A Sepharoseカラムクロマト行いさらに精製したところ、0.5M α-methylglucosideと1.3M α-methyl-mannosideによって溶出されるSTh受容体とに分離された。そこで最もSThと強く結合する70kDa蛋白を含む画分、1.3M α-methyl-mannoside画分に溶出されたSTh受容体をSTR-200Aとし、0.5M α-methylglucosideで溶出されたSTh受容体をSTR-200Bとした。STR-200BはSThと結合する二つのサブユニット(53kDa蛋白と77kDa蛋白)を有していた。従ってラットの腸管膜のSTh受容体は2種類ありいずれも糖蛋白であることが示唆された。興味深いことにSTR-200AとSTR-200Bの糖鎖は異なっており、STR-200Aの糖鎖はN-linked high mannoseタイプで、STR-200Bの糖鎖はN-linked complexタイプであった。現在STR-200Aの3本の糖鎖はSThとの結合に関与しないことがわかっている。またSTR-200AとSTR-200Bにはグアニレイトシクラ-ゼ活性は検出されていない。STh受容体精製の方法としてSThの活性アナロ-グにビオチンを3分子結合させたリガンドを作成し、これを用いたアフィニテイクロマトが有効であることがわかった。

研究重点是STh受体的纯化和结构分析。我们从大鼠小肠上皮细胞制备刷状缘细胞膜，并尝试使用各种表面活性剂溶解 STh 受体，结果发现 0.1% Lubrol PX 溶解 STh 受体最有效。因此，浓缩通过Lubrol PX处理获得的粗制STh受体后，进行Sephacryl S-300HR柱层析。分子量为 200,000 的级分通过光亲和标记与 STh 结合。检测到三种类型的蛋白质。 SDS-聚丙烯酰胺电泳测定的这三种蛋白的分子量分别为53,000、70,000和77,000，小于凝胶过滤测定的分子量200,000，表明STh受体由多个亚基组成。当通过Con A Sepharose柱层析进一步纯化此处获得的STh受体级分时，将其分离为由0.5M α-甲基葡萄糖苷和1.3M α-甲基-甘露糖苷洗脱的STh受体。因此，在1.3M α-甲基甘露糖苷级分中洗脱的STh受体被指定为STR-200A，该级分是含有与STh结合最强的70kDa蛋白质的级分，并且在0.5M α-甲基葡萄糖苷中洗脱的STh受体被指定为STR-200A。被指定为STR-200A -200B。 STR-200B 有两个结合 STh 的亚基（53kDa 蛋白和 77kDa 蛋白）。因此，推测大鼠肠膜上存在两种类型的STh受体，且均为糖蛋白。有趣的是，STR-200A和STR-200B的糖链不同，STR-200A的糖链是N-连接的高甘露糖类型，而STR-200B的糖链是N-连接的复合类型。目前已知STR-200A的三个糖链不参与与STh的结合。此外，在STR-200A和STR-200B中未检测到鸟苷酸环化酶活性。作为纯化 STh 受体的方法，我们创建了一种配体，其中三分子生物素与 STh 的活性类似物结合，并且发现使用该配体的亲和层析是有效的。