ヒト尿由来巨核球増殖刺激因子の精製と遺伝子クローニング

人尿源性巨核细胞生长刺激因子的纯化及基因克隆

基本信息

批准号：
63570575
负责人：
河北誠
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570575/
关键词：
巨核芽球細胞株増殖刺激因子再生不良性貧血患者尿大量精製

项目摘要

巨核球血小板系造血に関与する因子の研究は遅れている。その一つの原因として、活性測定法に鋭敏かつ再現性に富む方法がないことである。in vitroで巨核球コロニー形成を刺激するMeg-CSFは、従来報告された活性の殆どがIL-3によるとされている。しかしIL-3は巨核球系に特異的な因子ではなく、本造血系に特異的な刺激因子が存在することは充分に考えられる。我々は従来再生不良性貧血(再不貧)患者尿中に巨核球血小板造血を刺激する因子が存在することを報告し、その精製を試みてきたが、活性測定法が充分でなく、精製に困難をきたしていた。今回ヒト巨核芽球性細胞株CMKを入手し、それから得た亜株CMK-308が再不貧患者尿抽出物に反応して増殖することを見いだし、これを指標として活性因子の精製と遺伝子クローニングを試みている。前年度迄に小スケールの予備実験を行い、本因子がpI4〜5の酸性粁蛋白であることが推定されている。今年度は主に大量精製のための予備実験を行った。まず再不貧患者尿100lから得た粗標品(蛋白量として約2g)をDEAEセファロースにより分画した。標品を0.05M燐酸緩衝液(pH55)に溶解して展開後吸着画分を1.2MNaClで溶出した。CMK増殖活性は主に非吸着画分に回収されたが、一部吸着画分にも認められた。そこでまず非吸着画分に含まれる活性についてSP-5PWによる高速液体クロマトグラフィーを試みた。溶媒Aとして7M尿素を含むグリシン塩酸緩衝液(0.02M,pH3.5)、Bとして1MNaClを含むグリシン塩酸緩衝液を用いた。活性は40%Bの位置に単一なピークとして溶出された。そこで大量精製の第一歩として尿500l分の粗標品から出発し、DEAEセファロース、SP-5PWの2段階の部分精製標品を得た。現在100iから出発した標品について、種々のレクチンカラム、逆相系高速液体のロマトグラフィーを行い、精製条件を検討中である。

对巨核细胞血小板造血的因素的研究很慢。原因之一是没有敏感且可重复的方法进行活动测定方法。 MEG-CSF在体外刺激巨核细胞定植，据说是IL-3的大多数先前报道的活动。但是，人们认为IL-3不是巨核细胞系统的特定因素，并且存在造血系统特有的刺激因素。我们以前曾报道过，有一些因素会刺激性巨症（重生）患者尿液中的巨核细胞血小板造血作用，并试图净化它，但活性测定不足，使纯化变得困难。我们已经获得了人类巨细胞细胞系CMK，发现从其贫困较差的患者的尿液提取物中，从其获得的亚甲板CMK-308生长，并试图以此作为指示来纯化和克隆活性剂。初步实验是在上一年进行的，据估计，该因子是具有PI4-5的酸性硫蛋白。今年，我们主要进行了大量净化的初步实验。首先，使用DEAE SEPHAROSE分口，从100 L尿液中获得的粗制制剂（约2G蛋白质）。将制剂溶解在0.05m的磷酸盐缓冲液（PH55）中，并用12m NaCl洗脱吸附的馏分。 CMK生长活性主要集中在非吸附的部分中，但在某些吸附的部分中也收集。因此，首先，使用SP-5PW的高性能液相色谱法确定非吸附分数中包含的活性。使用含有7M尿素（0.02m，pH 3.5）的甘氨酸盐酸缓冲溶液作为溶剂A和含有1M NaCl的甘氨酸A和乙二醇盐酸缓冲溶液。该活动在40％B位置下洗脱为单个峰。作为质量纯化的第一步，我们从含有500升尿液的粗样品开始，并获得了两个部分纯化的样本阶段：Deae Sepharose和SP-5PW。当前，正在使用各种凝集素柱和相反的高性能液体从100i开始进行漫画进行准备，并研究了纯化条件。