ヒト尿由来巨核球増殖刺激因子の精製と遺伝子クローニング

人尿源性巨核细胞生长刺激因子的纯化及基因克隆

基本信息

批准号：
63570575
负责人：
河北誠
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63570575/
关键词：
巨核芽球細胞株増殖刺激因子再生不良性貧血患者尿大量精製

项目摘要

巨核球血小板系造血に関与する因子の研究は遅れている。その一つの原因として、活性測定法に鋭敏かつ再現性に富む方法がないことである。in vitroで巨核球コロニー形成を刺激するMeg-CSFは、従来報告された活性の殆どがIL-3によるとされている。しかしIL-3は巨核球系に特異的な因子ではなく、本造血系に特異的な刺激因子が存在することは充分に考えられる。我々は従来再生不良性貧血(再不貧)患者尿中に巨核球血小板造血を刺激する因子が存在することを報告し、その精製を試みてきたが、活性測定法が充分でなく、精製に困難をきたしていた。今回ヒト巨核芽球性細胞株CMKを入手し、それから得た亜株CMK-308が再不貧患者尿抽出物に反応して増殖することを見いだし、これを指標として活性因子の精製と遺伝子クローニングを試みている。前年度迄に小スケールの予備実験を行い、本因子がpI4〜5の酸性粁蛋白であることが推定されている。今年度は主に大量精製のための予備実験を行った。まず再不貧患者尿100lから得た粗標品(蛋白量として約2g)をDEAEセファロースにより分画した。標品を0.05M燐酸緩衝液(pH55)に溶解して展開後吸着画分を1.2MNaClで溶出した。CMK増殖活性は主に非吸着画分に回収されたが、一部吸着画分にも認められた。そこでまず非吸着画分に含まれる活性についてSP-5PWによる高速液体クロマトグラフィーを試みた。溶媒Aとして7M尿素を含むグリシン塩酸緩衝液(0.02M,pH3.5)、Bとして1MNaClを含むグリシン塩酸緩衝液を用いた。活性は40%Bの位置に単一なピークとして溶出された。そこで大量精製の第一歩として尿500l分の粗標品から出発し、DEAEセファロース、SP-5PWの2段階の部分精製標品を得た。現在100iから出発した標品について、種々のレクチンカラム、逆相系高速液体のロマトグラフィーを行い、精製条件を検討中である。

巨核细胞-血小板造血相关因素的研究相对滞后。造成这种情况的原因之一是缺乏灵敏且可重复的活性测量方法。先前报道的大多数 Meg-CSF 活性（在体外刺激巨核细胞集落形成）被认为是由 IL-3 引起的。但IL-3并不是巨核细胞系统特有的因子，很可能存在造血系统特有的刺激因子。我们之前报道过再生障碍性贫血（再贫血）患者的尿液中存在一种刺激巨核细胞血小板造血的因子，并试图纯化它，从而导致了问题。这次，我们获得了人巨核细胞系CMK，发现从中获得的亚株CMK-308响应贫困患者的尿液提取物而增殖。以此为指标，我们进行了活性因子的纯化我正在尝试基因克隆。前年进行了小规模的初步实验，推测该因子是一种酸性氧化蛋白，pI为4~5。今年我们主要进行了大规模纯化的初步实验。首先，使用 DEAE Sepharose 对从贫困患者的 100 升尿液中获得的粗样品（约 2 g 蛋白质）进行分级。将样品溶解在0.05M磷酸盐缓冲液(pH 55)中并显色，并用1.2M NaCl洗脱吸附的级分。 CMK增殖活性主要在非吸附级分中恢复，但在吸附级分中也观察到部分。因此，我们首先尝试使用 SP-5PW 进行高效液相色谱来检查非吸附级分中所含的活性。作为溶剂A，使用含有7M尿素的甘氨酸盐酸盐缓冲液(0.02M，pH 3.5)，作为溶剂B，使用含有1M NaCl的甘氨酸盐酸盐缓冲液。活性在 40%B 处以单峰形式洗脱。因此，作为大规模纯化的第一步，我们从500升尿液的粗样品开始，获得DEAE Sepharose和SP-5PW的两步部分纯化样品。我们目前正在使用各种凝集素柱和反相高性能液体对从100i开始的制备进行色谱分析，并且正在研究纯化条件。