ヒト骨肉腫細胞株HOSの産生する巨核球分化誘導因子の純化と遺伝子クローニング

人骨肉瘤细胞系HOS巨核细胞分化诱导因子的纯化及基因克隆

基本信息

批准号：
06671101
负责人：
河北誠
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06671101/
关键词：
巨核球分化誘導因子未分化甲状腺癌 IL-11 新規サイトカイン

项目摘要

HOS細胞培養上清中の巨核球分化誘導因子活性については、20Lの培養上清を調整し、純化を試みたが、精製過程を重ねると活性が分散し、未だ最終段階まで到達していない。そこでHOSとは別に、我々の研究室で樹立された未分化甲状腺癌細胞上清中に存在する同様な活性の純化に目標を切り替えた。KHM-5MはPCRで解析するとIL-6を産生している。そこで正常マウス骨髄非付着非貪食細胞の液体培養系でのAChE活性誘導を指標に、IL-6以外の活性を追跡した。無血清培養上清35Lを濃縮後、6Mグアニジン塩酸で溶解し、90%エタノール沈殿を行った。沈殿物を遠沈除去後、上清に残存する活性をRP-HPLCで精製した。IL-6よりも高濃度のアセトニトリルで溶出される活性画分をさらに二段階精製し、最終的に22kDaの純化標品を得た。SDS-PAGEゲルの切り出し実験で、AChE誘導活性分布と蛋白のピークは完全に一致したが、N末端アミノ酸配列を解析した結果、IL-11と確認された。しかしKHM-5Mの培養上清にはIL-11以外にも正常巨核球の分化誘導活性が認められたので、さら実験を続けた結果、新規蛋白の単離に成功した。詳細は投稿準備中だが、3段階の精製後、TSK-G300SW-XLによるゲル濾過で単一の活性ピークを示し(図4)、泳動ゲルの切り出しで活性は主蛋白バンドと一致した。そこでSDS-PAGEゲルから蛋白をPVDF膜に転写し、N末端20個のアミノ酸配列決定に成功、現在までに知られていない全く新しい蛋白と判明した。巨核球刺激因子(megakaryocyte stimulator,MKS)と仮称しているが、単独でマウス巨核球のAChE活性を誘導し、巨核球のploidyを高め、さらにmpl-リガンドとは相乗的に働く、これらのデータは全て、投稿準備中である。巨核球系造血では、mpl-リガンドが、非常に特異性が高く強力な因子として注目を浴びている。今回我々が純化したMKSが生理的な血小板産生にどの程度の役割を果たすのかは今後の課題である。現在遺伝子クローニングが進行中だが、成功後には、直ちに受容体の探索にとりかかるべく準備中である。

对于HOS细胞培养上清液中的巨核细胞分化诱导因子活性，我们制备了20μL培养上清液并试图对其进行纯化，但随着纯化过程的重复，活性分散，尚未达到最终阶段。因此，我们将目标转向纯化我们实验室建立的未分化甲状腺癌细胞上清液中存在的与 HOS 不同的类似活性。通过 PCR 分析时，KHM-5M 会产生 IL-6。因此，我们通过在正常小鼠骨髓非贴壁非吞噬细胞的液体培养系统中诱导AChE活性来追踪除IL-6之外的活性。浓缩35μL无血清培养上清后，溶解于6M盐酸胍，并用90％乙醇沉淀。离心除去沉淀后，通过RP-HPLC纯化上清液中剩余的活性。用浓度高于IL-6的乙腈洗脱的活性级分进一步分两步纯化，最终得到22 kDa的纯化样品。在SDS-PAGE凝胶切除实验中，AChE诱导的活性分布和蛋白质峰完全匹配，但N端氨基酸序列分析证实它是IL-11。然而，除了IL-11之外，KHM-5M的培养上清液还被发现具有诱导正常巨核细胞分化的活性，并且通过进一步的实验，他们成功分离出了一种新的蛋白质。细节正在准备提交，但经过三步纯化后，使用 TSK-G300SW-XL 的凝胶过滤显示出单个活性峰（图 4），并且当切下电泳凝胶时，活性与主要蛋白质条带匹配。因此，将该蛋白从SDS-PAGE凝胶转移到PVDF膜上，并成功对N端20个氨基酸进行测序，揭示出它是一种此前未知的全新蛋白。这些数据表明，暂定名为巨核细胞刺激剂（MKS），它单独诱导小鼠巨核细胞中的AChE活性，增加巨核细胞倍性，并与mpl-配体协同作用，所有这些都为发布做好准备。在巨核细胞造血过程中，mpl-配体作为一种高度特异性和强大的因子而引起人们的关注。我们这次纯化的MKS在生理性血小板生成中发挥的作用程度仍然是一个未来的问题。目前正在进行基因克隆，一旦成功，将立即开始寻找受体。