巨核球の増殖分化を刺激する新しいサイトカインの純化と遺伝子クロ-ニング

刺激巨核细胞增殖和分化的新型细胞因子的纯化和基因克隆

基本信息

批准号：
03671192
负责人：
河北誠
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03671192/
关键词：

项目摘要

本年度はヒト巨核球性白血液細胞株CMKの増殖を刺激する因子の純化を試みた。活性測定はCMKより当科で樹立した樹立した亜株CMKー308を用いたMTT法によった。ヒト成人T細胞白血病由来HTLVーI感染T細胞株K3Tの無血清培養上清200Lを出発材料とした。まずYMー10限外ろ過膜により濃縮坂DEAEーセファロ-ズCLー6Bカラム,次いでブル-セファロ-CLー6Bカラムにて分画した。得られた活性画分をDZAZー5PW高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)により分画したところNacl濃度の0.1M及び0.2Mの位置に2つの活性画分を得た(FrI,II)。次に2つの画分をHCAーHPLCで分画したところ,FrIは単一の活性ピ-ク,FrIIは更に2つの活性ピ-ク(FrIIa,IIb)に分画された。この時点で各種サイトカインに対する抗体による中和試験を行った。その結果,画分IIa及びIIbは抗GMーCSF抗体,抗ILー3抗体,抗ILー6抗体の混合溶液でほぼ完全に中和された。更に各抗体の単独添加では抗GMーCSF抗体により、中和されたところから、IIa,IIn画分中の殆どがGMーCSFによると推定された。しかしFrIaの活性はこれらの抗体では中和されず,GMーCSF,ILー3,ILー6以外の因子が存在すると考えられる。一方K3Tの各種因子の産生をmRNAのレベルでPCR法を用いて解析した。その結果K3Tは無血清培養ではMーCSF,GMーCSF,ILー1α,ILー6,ILー9,TGFーβのmRNAの発現が認められた。しかしMーCSF,ILー1,ILー9,TGFーβにはCMKには反応せず,またFrIの活性はGMーCSF,ILー3,ILー6抗体では中和されないことから,これら既知因子以外の新しいサイトカインが含まれる可能性が示唆された。更にCMKの巨核球系表面形値である血小板膜粁蛋白IIb/IIIaの発現を検討すると,K3T培養上清は、IIb/IIIaの発現率を15%から50%へ上昇させるが,この活性もGMーCSF,ILー3,ILー6に対する抗体では中和されなかった。現在FrIの活性について,更に培養上清を大量調製して精製を試みている。

今年，我们试图净化刺激人巨核细胞白细胞系CMK生长的因素。使用MTT方法使用CMK在我们部门中建立的已建立的子支架CMK-308来衡量活动。 HTLV-I感染的T细胞系K3T的无血清培养上清液，源自人类成人T细胞白血病，用作起始材料。首先，使用浓缩的Saka Deae-Cephaloz CL-6B色谱柱上的YM-10超滤膜分离细胞，然后在Brucephalo-CL-6B色谱柱上分离。通过DZAZ-5PW高性能液相色谱（HPLC）分馏所获得的活性分数，并在0.1m和0.2m的NaCl浓度（FRI，II）处获得了两个活性分数。然后通过HCA-HPLC分馏这两个级分，从而将周五分为单个活跃的选择，然后将FRII进一步分配为两个主动选片（Friia，iib）。此时，使用对各种细胞因子的抗体进行中和测试。结果，IIA和IIB分数几乎被抗GM-CSF抗体，抗IL-3抗体和抗IL-6抗体的混合溶液完全中和。此外，当单独添加每种抗体时，它用抗GM-CSF抗体中和，据估计，大多数IIA和IIN级分是基于GM-CSF。但是，Fria的活性并未用这些抗体进行中和，并且认为除GM-CSF，IL-3和IL-6以外的其他因素存在。同时，使用PCR在mRNA水平上分析了K3T的各种因子的产生。结果，K3T在M-CSF，GM-CSF，IL-1α，IL-6，IL-9和TGF-β的无血清培养物中表达mRNA。然而，M-CSF，IL-1，IL-9，TGF-β没有对CMK响应，并且FRI活性未被GM-CSF，IL-3，IL-6抗体中和，这表明可能包括除这些已知因素以外的其他新细胞因子。此外，研究血小板巨核细胞蛋白IIB/IIIA的表达是CMK的表面形状时，K3T培养上清液将IIB/IIIA的表达率从15％提高到50％，但该活性并未通过针对GM-CSF，IL-3和IL-3和IL-6和IL-6的抗体中和。目前，我们正在尝试通过准备大量培养上清液来净化周五的活动。