巨核球の増殖分化を刺激する新しいサイトカインの純化と遺伝子クロ-ニング

刺激巨核细胞增殖和分化的新型细胞因子的纯化和基因克隆

基本信息

批准号：
03671192
负责人：
河北誠
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03671192/
关键词：

项目摘要

本年度はヒト巨核球性白血液細胞株CMKの増殖を刺激する因子の純化を試みた。活性測定はCMKより当科で樹立した樹立した亜株CMKー308を用いたMTT法によった。ヒト成人T細胞白血病由来HTLVーI感染T細胞株K3Tの無血清培養上清200Lを出発材料とした。まずYMー10限外ろ過膜により濃縮坂DEAEーセファロ-ズCLー6Bカラム,次いでブル-セファロ-CLー6Bカラムにて分画した。得られた活性画分をDZAZー5PW高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)により分画したところNacl濃度の0.1M及び0.2Mの位置に2つの活性画分を得た(FrI,II)。次に2つの画分をHCAーHPLCで分画したところ,FrIは単一の活性ピ-ク,FrIIは更に2つの活性ピ-ク(FrIIa,IIb)に分画された。この時点で各種サイトカインに対する抗体による中和試験を行った。その結果,画分IIa及びIIbは抗GMーCSF抗体,抗ILー3抗体,抗ILー6抗体の混合溶液でほぼ完全に中和された。更に各抗体の単独添加では抗GMーCSF抗体により、中和されたところから、IIa,IIn画分中の殆どがGMーCSFによると推定された。しかしFrIaの活性はこれらの抗体では中和されず,GMーCSF,ILー3,ILー6以外の因子が存在すると考えられる。一方K3Tの各種因子の産生をmRNAのレベルでPCR法を用いて解析した。その結果K3Tは無血清培養ではMーCSF,GMーCSF,ILー1α,ILー6,ILー9,TGFーβのmRNAの発現が認められた。しかしMーCSF,ILー1,ILー9,TGFーβにはCMKには反応せず,またFrIの活性はGMーCSF,ILー3,ILー6抗体では中和されないことから,これら既知因子以外の新しいサイトカインが含まれる可能性が示唆された。更にCMKの巨核球系表面形値である血小板膜粁蛋白IIb/IIIaの発現を検討すると,K3T培養上清は、IIb/IIIaの発現率を15%から50%へ上昇させるが,この活性もGMーCSF,ILー3,ILー6に対する抗体では中和されなかった。現在FrIの活性について,更に培養上清を大量調製して精製を試みている。

今年，我们尝试纯化刺激人巨核细胞白血病细胞系 CMK 增殖的因子。使用我们部门建立的亚菌株CMK-308，通过MTT法测定活性。起始材料是源自人成体T细胞白血病的HTLV-I感染的T细胞系K3T的200μL无血清培养物上清液。首先，使用浓缩斜率DEAE-Sepharose CL-6B柱，使用YM-10超滤膜进行分级，然后使用Blue-Sephaloze CL-6B柱进行分级。将获得的活性级分通过DZAZ-5PW高效液相色谱(HPLC)进行分级，得到NaCl浓度为0.1M和0.2M的两个活性级分(FrI、II)。接下来，通过HCA-HPLC对两个级分进行分级，并且FrI被分离成单个活性峰，并且FrII被进一步分离成两个活性峰（FrIIa和IIb）。此时，使用针对各种细胞因子的抗体进行中和测试。结果，级分IIa和IIb几乎被抗GM-CSF抗体、抗IL-3抗体和抗IL-6抗体的混合溶液完全中和。此外，当单独添加各抗体时，其被抗GM-CSF抗体中和，因此估计大部分IIa和IIn级分是GM-CSF。然而，FrIa 活性并未被这些抗体中和，表明可能存在 GM-CSF、IL-3 和 IL-6 以外的因子。同时，使用PCR在mRNA水平上分析各种K3T因子的产生。结果，在K3T的无血清培养物中，观察到M-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-6、IL-9和TGF-βmRNA的表达。然而，M-CSF、IL-1、IL-9 和 TGF-β 不与 CMK 反应，并且 FrI 活性不被 GM-CSF、IL-3 和 IL-6 抗体中和。可能涉及已知因素以外的细胞因子。此外，当检查血小板膜蛋白IIb/IIIa（CMK的巨核细胞表面值）的表达时，K3T培养物上清液将IIb/IIIa的表达率从15%增加至50%，但这种针对GM的抗体活性也增加。 -CSF、IL-3和IL-6不能中和它。目前，我们正在尝试通过制备大量培养上清来进一步纯化FrI的活性。