ミトコンドリアサイトパチーにおけるミトコンドリアDNA塩基配列の解析

线粒体细胞病中线粒体 DNA 碱基序列分析

• 批准号: 62617520
• 负责人: 宝来 聰
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1987
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1987 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62617520/
• 关键词: ミトコンドリアサイトパチー; ミトコンドリアDNA; DNA多型; ミトコンドリアサイトパチー; ミトコンドリアDNA; DNA多型

近年ミトコンドリア・サイトパチー等の疾患において, ミトコンドリアゲノムの欠陥, あるいは関与が問題にされている. 患者試料は血液あるいは微量の生検組織に限られるため, 我々らが行って来たような精製したmtDNAを用いる分析は困難である. またサザンブロット法では, 分解能に限界があり, ゲノム中に大きな欠失・挿入があった場合にしか変化が観察されない. このため, 近年開発された変性剤濃度勾配電気泳動法(DGGE法)を用いた, mtDNAにおけるミスマッチの同定法への応用を試みた. 正常人2個体より精製したmtDNAの2.1KbのPst1断片をpUC19にクローニングした. この2個体のmtDNAのうち一方は制限酵素による分析でこのPst1断片中に9bpの欠失があることがわかっている. クローニングされた2種類のDNAを等量ずつ混ぜた後, 熱変性, 再結合するとホモデュプレックス2種類とヘテロデュプレックス2種類の混合物ができる. この混合物を, インサートをさらに切断するような制限酵素で消化し, DGGEにより泳動方向と平行に変性剤の濃度勾配をつけたゲルで, 60°C温度を保ちながら泳動する. ヘテロデュプレックス中に塩基置換等によるミスマッチがあると低い変性濃度二本鎖DNAの部分解離がおこり, その高次構造の変化によって易動度がおそくなるためホモデュプレックスと区別できる. 実際, 上述の混合物をRsaIで 切断し, DGGEで分析すると, 一方に欠失のある相同断片同士のヘテロデュプレックスでは, かなりの易動度の遅滞がみられた. さらに別の断片のヘテロデュプレックスでも易動度の遅滞が観察され, シークエンスによる分析で, この2種類のmtDNA断片の塩基配列には1塩基置換があることが明らかになった. この方法では, ミトコンドリア・サイトパチーの患者試料を用いた場合でも正常人試料との比較によって, どの部位で塩基置換がしるかをまず決め, その後シークエンスにらる分析に発展できる利点がある.

近年来，线粒体基因组的缺陷或参与一直是线粒体和细胞病等疾病中的一个问题。患者样品仅限于血液或痕量活检组织，因此很难像我们所做的那样使用纯化的mtDNA进行分析。此外，Southern印迹方法的分辨率有限，并且只有在基因组中存在较大的缺失或插入时才能观察到变化。因此，我们尝试使用最近开发的变性浓度梯度电泳（DGGE）应用方法来鉴定MTDNA中的错配。从两个正常个体纯化的mtDNA的2.1 kb Pst1片段被克隆到PUC19中。发现这两个个体的mtDNA之一通过使用限制酶进行分析，在该PST1片段中具有9bp缺失。将两个克隆的DNA平均在一个部分中混合后，当进行热变性和重组时，形成了两个同型相吻合的混合物和两个异源链状的混合物。用限制酶消化该混合物，该酶进一步切割插入物，并在60°C的温度下在凝胶上以浓度梯度平行于与使用DGGE迁移方向平行的浓度梯度。如果由于基础取代等导致异源性动力的不匹配等，则会发生低降低浓度的双链DNA的部分解离，并且高阶结构的变化会导致迁移率较慢，这可以与同型相吻合区分开。实际上，当将上述混合物用RSAI裂解并用DGGE分析时，在具有单方面缺失的同型电子化合物之间观察到显着的迁移率延迟。此外，在另一个片段的杂质中观察到迁移率延迟，并通过测序分析表明，这两种类型的mtDNA片段的基础序列中有一个基本替代。该方法的优点是，即使使用线粒体细胞病的患者样品，也可以首先确定将通过将其与正常的人类样本进行比较，然后基于序列进行分析来确定基础替代。