大腸菌染色体複製の開始機構

大肠杆菌染色体复制的启动机制

• 批准号: 62580208
• 负责人: 小川 徹
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1987
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1987 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62580208/
• 关键词: DNA複製; oriC; DnaA蛋白; HU蛋白; RNAポリメラーゼ

染色体DNAの複製は起点における開始反応のレベルで制御されている. 大腸菌では複製起点(oriC)を持つプラスミドの複製反応を精製酵素を用いて再構成することが可能になりつつある. oriCでの複製蛋白複合体の形成に先がけて開始蛋白DnaAの他にRNAポリトラーゼとHU蛋白がoriCDNAに作用することが示唆されているが, その機能は不明である. これら2種類の蛋白の複製開始における機能を知る目的で以下の研究を行なった. 1.転写産物の解析:oriCDNAを鋳型に用いてRNAポリメラーゼによる転写反応を行ない, 転写物の解析を行なった. oriCに右接する16KD蛋白遺伝子の転写が複製制御に関与する事が知られているが, この転写はDnaAにより抑制される事が判明した. RNAポリメラーゼとDnaAのバランスが転写抑制の程度に影響を及ぼすが, 実際に複製開始反応が起きる条件で転写制御が起さる事が示唆された. 次にoriC近傍での他の転写物を探索した所, oriC内177番目の塩基からunc遺伝子方向に転写が起きる事が判明した. この転写物は蛋白をコードしておらず, DnaAおよびHU蛋白により転写が抑制される. 16KD遺伝子の転写は複製開始に必須でない事が判明しており, 今回新たに見出されたoriC内で開始する転写が複製開始に直接関与している可能性が考えられる.2.HU蛋白欠損株におけるDNA複製:今本(理研)らによって分離されたHU蛋白欠損株におけるDNA複製の様式を解析した. この株はHU蛋白を完全に欠失しているが生育可能で, oriCから複製開始することが判明した. 核様体の構造異常が見られ, また核様体の分配機構, 細胞分裂機構の異常が観察された. 粗酵素画分での解析から, 他の核様体蛋白が複製開始反応に際してHU蛋白の代りを務めている可能性が示唆された.

染色体DNA的复制被控制在起始反应的水平上。在大肠杆菌中，使用纯化的酶重建具有复制起点(oriC)的质粒的复制反应已成为可能。除了起始蛋白DnaA之外，RNA聚合酶和HU蛋白在复制蛋白复合物形成之前作用于oriCDNA，但它们的功能尚不清楚。为了了解这两类蛋白质在复制起始中的功能，我们进行了以下研究： 1.转录本分析：我们以oriCDNA为模板，使用RNA聚合酶进行转录反应，并分析了16KD蛋白质基因的转录本。已知与 oriC 相邻的基因参与复制控制，并且发现这种转录被 DnaA 抑制。虽然RNA聚合酶和DnaA之间的平衡会影响转录抑制的程度，但有人认为转录调控是在复制起始反应实际发生的条件下发生的。接下来，我们寻找了oriC附近的其他转录本，结果发现。转录从 oriC 的第 177 个碱基开始，向 unc 基因方向进行。该转录物不编码蛋白质，并且转录被 DnaA 和 HU 蛋白质抑制。已发现16KD基因的转录对于复制起始不是必需的，并且新发现的在oriC内起始的转录可能直接参与复制起始2.HU蛋白缺陷菌株中的DNA复制：我们分析了复制起始。 Imamoto (RIKEN) 等人分离的 HU 蛋白缺陷菌株中的 DNA 复制模式 尽管该菌株完全缺乏 HU 蛋白，但它是可行的并从 oriC 开始复制。观察到类核的结构异常以及类核分布机制和细胞分裂机制的异常。对粗酶级分的分析表明，其他类核蛋白在复制起始反应期间与 HU 蛋白相互作用。他可能是作为替补。