細胞周期に依存したDnaA蛋白の活性制御機構

细胞周期依赖性DNAA蛋白活性控制机制

基本信息

批准号：
06247205
负责人：
小川徹
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06247205/
关键词：
DNA複製 DnaA蛋白細胞周期細胞分裂

项目摘要

大腸菌の染色体複製は主に開始反応の段階で厳密に制御されているが、その分子機構は不明である。我々は複製開始蛋白DnaAの活性が何らかの機構により調節されており、細胞周期の特定の時期に開始反応を導くことが可能になるという仮説の下に研究を行なっており、本年度は下記の結果を得た。1.細胞周期に対応してdnaA遺伝子の転写量は大きく変動しており、複製開始時期に最大となっている。しかしながらDnaA蛋白はmRNAほど顕著には変動していない。。これはDnaA蛋白が一世代以上にわたって安定に存在しているからである。従ってDnaA蛋白濃度のわずかな上昇により開始反応が引き起こされていると考えられる。2.安定DNA合成を利用して部位特異的なdnaA変異株を作成する方法を開発し、機能不明のN端側領域に変異を持つ株5種類を単離した。これらの変異株はこれまでに得られていた中央部およびC端側に変異を持つ株と異なる性質を示すことから、N端側領域も複製開始に重要な機能を持つことが示唆された。またin vivoでDnaA蛋白のDNAへの結合能を調べる系を開発し、得られた変異により結合能が低下することを明らかにした。さらに、マルチコピーサプレッサーを多数単離し、解析を行なった。これらの中にはN端側変異を特異的に抑制するものがあり、これらの遺伝子を同定することによりDnaAの活性調節機構を解明できるのではないかと考えている。3.染色体地図上95分付近にDnaA蛋白が非常に強く結合する領域が存在し、この領域にDnaA蛋白により抑制されているプロモーター活性が存在することを見出した。この領域を持つプラスミドが細胞内に数コピー存在すると細胞分裂は阻害される。この細胞分裂阻害機構の研究を通して複製開始反応と細胞分裂の共役機構が解明できるものと期待している。

大肠杆菌中的染色体复制主要在起始反应阶段受到严格控制，但其分子机制尚不清楚。我们正在进行研究，假设复制起始蛋白DnaA的活性受到某种机制的调节，使得在细胞周期的特定阶段引导起始反应成为可能。今年，我们得到了以下结果。它。 1. dnaA基因的转录水平随细胞周期而大幅波动，在复制开始时达到最大值。然而，DnaA 蛋白的波动并不像 mRNA 那样明显。。这是因为 DnaA 蛋白稳定存在超过一代。因此，认为起始反应是由DnaA蛋白浓度的轻微增加引发的。 2.我们开发了一种利用稳定DNA合成来创建位点特异性DNAA突变体的方法，并分离出5个在功能未知的N末端区域发生突变的菌株。这些突变菌株表现出与之前获得的在中央和C末端区域发生突变的菌株不同的特性，表明N末端区域在复制起始中也具有重要功能。我们还开发了一个系统来检查DnaA蛋白在体内与DNA结合的能力，发现由此产生的突变降低了结合能力。此外，我们分离了大量的多拷贝抑制子并对其进行了分析。其中一些基因特异性抑制N端突变，我们相信通过鉴定这些基因，我们将能够阐明DnaA活性的调控机制。 3.我们发现在染色体图谱上95分钟标记附近有一个区域与DnaA蛋白结合非常牢固，并且该区域存在被DnaA蛋白抑制的启动子活性。当细胞中存在含有该区域的质粒的多个拷贝时，细胞分裂就会受到抑制。我们希望通过对这种细胞分裂抑制机制的研究，能够阐明复制起始与细胞分裂之间的耦合机制。