大腸菌染色体複製開始における転写およびDnaA蛋白の機能

DnaA 蛋白在大肠杆菌染色体复制起始中的转录和功能

基本信息

批准号：
03261207
负责人：
小川徹
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-03261207/
关键词：
oriC DNA複製転写複製開始反応緊縮調節

项目摘要

複製開始に関与するRNAを知る目的で、まず大腸菌プラスミドを用いてoriC近傍に存在するプロモ-タ-からの転写開始がプラスミドの複製能に及ぼす影響を検討した。複製能はpolA株トランスフォ-メ-ションの効率、トランスフォ-マント中でのプラスミドのコピ-数及び安定性、さらにin vitro複製反応における鋳型活性を測定することにより検定した。その結果、これまで示唆されていたmioCプロモ-タ-からの転写以上に、oriCに左接するgidプロモ-タ-からの左向きの転写が複製開始により大きく関与しており、両方の転写が協調的に寄与していることが示唆された。またこれら2つのプロモ-タ-からの転写は緊縮調節を受けていることが判明した。次に転写反応の複製開始への関与の様式を知る目的で、最少必須領域を含み、gidおよびmioCプロモ-タ-は含まないoriCとpBR322のキメラプラスミドを作成し、このプラスミドにラクト-スオペロンプロモ-タ-を挿入して、プロモ-タ-の位置および方向とプラスミドの複製能との関係を検討した。oriCの左側から左向きに進む転写が最も複製活性化に効果があり、次にoriC右外側から左向きにoriCを通過する転写が複製活性化能があることが判明した。また、oriCの左外側から右向きにoriCを通過する転写は複製活性化能が非常に低いことが判明した。in vivoでは転写はRーloop形成ではなくDNAに負の超らせん構造を与えることによりDnaAによる二本鎖開裂を引き起こすというモデルが、より妥当と考えられる。一方、宿主染色体上のgidおよびmioCの両プロモ-タ-を同時に欠失させても細胞の増殖に見かけ上の変化はあらわれないことが判明した。この菌株における開始反応の機構は不明である。

为了了解参与复制起始的RNA，我们首先使用大肠杆菌质粒研究了位于oriC附近的启动子的转录起始对质粒复制能力的影响。通过测量polA菌株转化效率、转化体中质粒的拷贝数和稳定性以及体外复制反应中的模板活性来测定复制能力。因此，来自与 oriC 左侧相邻的 gid 启动子的向左转录比来自 mioC 启动子的转录更多地参与复制起始（迄今为止已表明），并且两种转录是协调的。有人建议这有助于此外，发现这两个启动子的转录受到严格的调控。接下来，为了了解参与转录反应的复制起始的模式，我们创建了oriC和pBR322的嵌合质粒，其包含最小必需区域但不包含gid和mioC启动子，并将乳糖操纵子添加到插入该质粒，并研究启动子的位置和方向与质粒的复制能力之间的关系。研究发现，从 oriC 左侧向左进行的转录对于激活复制最为有效，其次是从 oriC 右侧外侧向左进行的转录。另外，发现从oriC左侧外侧到右侧经过oriC的转录激活复制的能力非常低。在体内，一个更合理的模型是转录通过赋予 DNA 负超螺旋结构而不是 R 环形成来诱导 DnaA 双链切割。另一方面，研究发现同时删除宿主染色体上的gid和mioC启动子并不会引起细胞增殖的任何明显变化。该菌株中引发反应的机制尚不清楚。