大腸菌染色体複製開始における転写およびDnaA蛋白の機能

DnaA 蛋白在大肠杆菌染色体复制起始中的转录和功能

基本信息

批准号：
04256213
负责人：
小川徹
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04256213/
关键词：
DNA複製 oriC DnaA

项目摘要

大腸菌染色体の複製開始にはRNAポリラーゼによる転写反応が関与していることを古くから示唆されているが、その実体および機能については不明な点が多い。oriCプラスミドを用いたin vivoの研究から、我々はoriCの左側にあるgid遺伝子のプロモーターからの左向きの転写が複製開始に重要な役割を担っており、oriCの右側にあるmioC遺伝子のプロモーターからの左向きの転写も補助的に開始反応に関与していることを明らかにしてきた。これらの両プロモーターを欠失させた場合は人為的に挿入したプロモーターに依存して複製可能であるが、このプロモーターは本来のgidやmioCプロモーターと同様に左向きの場合が複製活性化能が高く、oriCの左側からoriC内に向かう複製は活性化能を示さない。これらの結果からRNAポリメラーゼの後方にできる負のスーパーコイルがDnaA蛋白によるopen comples形成反応を促進する可能性が考えられる。一方、染色体上のgidおよびmioCプロモーターからの転写を欠失させても見かけ上細胞の増殖はあまり影響を受けず、この場合には他の転写が活性化に関与している可能性も考えられる。温度感受性のdnaC変異株を用いてDNA合成を同調化させてgidおよびmioCの転写産物を定量したところ、前者は複製開始直後に顕著な阻害を受けるのに対して後者は複製開始直前に顕著な阻害を受けることが判明した。DnaA変異株を用いた解析からこの阻害はmioC遺伝子のプロモーター上流のDnaA boxへのDnaA蛋白の周期的結合によることが示唆された。DnaA蛋白の細胞内濃度は細胞周期を通して一定であると考えられているが、DNA上の特定の部位においてはかなり変化しているものと思われる。

尽管长期以来人们认为RNA聚合酶的转录反应参与了大肠杆菌染色体复制的启动，但其实体和功能仍有许多未知之处。通过使用oriC质粒的体内研究，我们发现位于oriC左侧的gid基因启动子的向左转录在复制起始中起着重要作用，而位于右侧的mioC基因启动子的向左转录在复制起始中起着重要作用。 oriC侧在复制起始中起重要作用，已揭示左向转录也以辅助方式参与起始反应。当这两个启动子都被删除时，依赖于人工插入的启动子，复制是可能的，但是该启动子与原始的gid和mioC启动子一样，当其朝向左侧时具有更高的激活复制的能力。 oriC转化为oriC不显示激活能力。这些结果表明，RNA聚合酶后部形成的负超螺旋可能促进DnaA蛋白的开放复合物形成反应。另一方面，删除染色体 gid 和 mioC 启动子的转录似乎对细胞增殖没有太大影响，表明其他转录可能参与激活。当我们使用温度敏感的 dnaC 突变株同步 DNA 合成并对 gid 和 mioC 的转录本进行定量时，我们发现前者在复制开始后立即受到显着抑制，而后者在复制开始前立即显着受到抑制。原来是被抑制了。使用 DnaA 突变体进行的分析表明，这种抑制是由于 DnaA 蛋白与 mioC 基因启动子上游的 DnaA 盒周期性结合所致。虽然 DnaA 蛋白的细胞内浓度被认为在整个细胞周期中是恒定的，但它在 DNA 上的特定位点似乎变化很大。