L因子ベクターの応用:動物培養細胞中でのLFベクター上遺伝子の活性化と物質生産

L因子载体的应用：LF载体上基因的激活和培养动物细胞中的物质生产

基本信息

批准号：
62560095
负责人：
西森克彦
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至 1988
项目状态：
已结题

项目摘要

Lファクター(LF)のエンハンサー部分とポリオーマウィルス(PyVA2)及びポリオーマECシミュータント(PyVN2)のエンハンサー部分を交換し、さらにこれにpHSG274由来のG418耐性遺伝子を連結した2種のプラスミドpPy274とpPyEC274を作製し、これら及び元型となったLF由来プラスミドpLIIN5をそれぞれマウスEC細胞であるF9細胞にCaPi法にて導入した。そしてこれらのプラスミドを安定に持つ株の樹立頻度を比較したところpLIIN5に比べpPy274ではその約1/20、またpPyEC274ではプラスミドとして安定に維持している株を取得することはできなかった。一方DNA導入後24〜80時間までの細胞内におけるこれらのプラスミドの一時的複製をみると、pPyEC274は高い効率で複製しており、これに比べpLIIN5やpPy274ではほとんど複製は観察できなかった。この結果は、CAT遺伝子をリポーター遺伝子としてLファクター、pyVA2株及びPyVN2株のエンハンサーの未分化F9細胞中での活性を調べた結果とも一致した。これらの結果はF9細胞中に於けるこれらのポリオーアウィルス由来、及びLF由来のエンハンサー活性、及び一時的複製の効率と、これらのDNAがF9細胞中に安定なプラスミドとして存在する株の樹立頻度に逆の相関性があることを示唆している。この結果はMol.Cell.Biol.Vol18,1988,pp2097-2104に投稿、掲載された。またLF上に様々なエンハンサー/プロモーターを連結し、リポーター遺伝子としてCAT遺伝子をこれらの配列の下流につないだpLMC2(MuLVLTR)、pLSC2(SV40初期遺伝子)、pLGC2(マウスβ-グロビン5'上流配列)等を作製し、これらをF9細胞に導入した。これらのプラスミドはF9細胞中でプラスミドとして安定に存在し、またLチノイン酸添加に伴うF9細胞の分化に従ってそれぞれのエンハンサー/プロモーターの性質にほぼ一致する転写の促進が観察された。この結果については現在投稿準備中である。

与多瘤病毒（PYVA2）的增强子部分（PYVA2）和多瘤EC（PYVN2）（PYVN2）的增强子（LF）的增强子部分交换，并进一步制备PPY274和PPYEC274的两个质粒PPY274和PPYEC274，其中g418抗性基因的g418抗性基因链接到lffsg274 and lff sehlanced and lff sehlanced and lff。将PPYEC274连接，并使用CAPI方法将原型LF衍生的质粒Pliin5分别引入了小鼠EC细胞中。当我们比较稳定携带这些质粒的菌株的建立频率时，与PPY274相比，与PPYEC274相比，不可能获得稳定为质粒的菌株，因此无法获得稳定为质粒的菌株。另一方面，当我们查看DNA引入DNA后24至80小时的这些质粒的瞬时复制时，PPYEC274以高效率复制，相比之下，PLIIN5和PPY274几乎没有复制。该结果也与检查L因素的活性，PYVA2的增强子和PYVN2菌株在未分化的F9细胞中使用CAT基因作为报告基因的结果一致。这些结果表明，来自F9细胞中这些多病毒和LF的增强活性，瞬态复制的效率，以及这些DNA在F9细胞中以稳定质粒而存在的菌株的频率。结果发布并发布在Mol.cell.biol.vol.vol18,1988，第2097-2104页中。各种增强子/启动子与LF相关，作为记者基因PLMC2（MULVLTR），PLSC2（SV40早期基因），PLGC2（小鼠β-珠蛋白5'上游的上游序列），制备了这些序列和这些序列中的猫基因和F9的cat基因。这些质粒在F9细胞中稳定地存在为质粒，并且观察到转录促进与根据L-二氨基酸的添加而分化了F9细胞的分化，与各个增强子/启动子的特性大致一致。结果目前正在准备提交。