GDF-9とc-kitリガンドのマウス卵巣卵胞の発達における機能の相互作用の研究

GDF-9与c-kit配体在小鼠卵泡发育中功能相互作用的研究

基本信息

批准号：
09264202
负责人：
西森克彦
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09264202/
关键词：
GDF-9 TGF-β C-kit スティールファクター卵巣

项目摘要

平成九年度GDF-9遺伝子欠損マウスでは卵胞が発達せず一時卵胞の段階で卵胞の発達が止まること、その卵巣mRNA中でc-kit ligand転写物が5倍程度に増加している現象が見られた。これに対し、growth factorの一種であるc-kit ligand遺伝子に欠陥があるSteel Pandaと呼ばれるmutantマウスで、GDF-9遺伝子欠損マウスと同様の卵胞発育不全が起きることが知られていたが、本研究の第一の目的はSteel Panda mutantマウスを入手し、その卵胞中でのGDF-9遺伝子の発現を観察し、発現に何らかの影響を受けていることを確認することであった。しかし、97年度中には所有者との交渉が前進せず、ミュータントマウスを入手でき図、研究が開始できなかった。幸い、近日中にsteel変異種を入手できる情勢となった。本研究のもう一つの目的は、単離したGDF-9蛋白を得て、そのレセプターを探索し、このGDF-9の情報伝達経路に関する知見を得ようというものである。筆者は、過去にCHO細胞での発現をマウスGDF-9遺伝子を用いて試みたが、プロテオリシスを受けていない単量体の前駆体産物が細胞膜、細胞質画分に発現していることは確認したものの、産物の培地中への分泌は確認できなかった。そこでTGF-βスーパーファミリィーに属するXenopusのVg-1のように、BMP2やアクチビンβBのプロシーケンスにつなぐことで分泌に成功した例にならい、マウスGDF-9及びヒトGDF-9cDNAをratBMP-2、及びヒトアクチビンβBcDNAの前駆体部分につないだコンストラクトを作成し、この発現ベクターをCV-1細胞、及び293細胞に導入したところ、細胞質中の蛋白に抗GDF-9ペプチド抗血清に反応する産物が見られ、またいくつかのクローンの培養培地上清中に微量ながらも抗血清に反応する物が存在している事を見いだした。検出系の改良など課題は多く残されているが、我々はこの結果よりヒト、及びマウス型の活性型GDF-9蛋白を得ることは十分可能と考えている。

1997年，观察到GDF-9基因缺陷的小鼠中，卵泡不发育，卵泡发育在临时卵泡阶段停止，并且卵巢mRNA中的c-kit配体转录物增加了约五倍。另一方面，已知名为“Steel Panda”的突变小鼠的 c-kit 配体基因（一种生长因子）有缺陷，会出现与 GDF-9 基因缺陷小鼠类似的卵泡发育缺陷。研究的第一个目的是获得Steel Panda突变小鼠，观察其卵泡中GDF-9基因的表达，并确认表达受到某种影响。然而，1997财年与所有者的谈判没有取得任何进展，无法获得突变小鼠或开始研究。幸运的是，情况已经变得如此，钢制变体很快就会上市。本研究的另一个目的是获得分离的GDF-9蛋白，寻找其受体，并了解GDF-9信号转导通路。作者之前尝试使用小鼠GDF-9基因在CHO细胞中表达，但证实未经过蛋白水解的单体前体产物在细胞膜和细胞质级分中表达，但产物无法分泌到培养基中。确认的。因此，仿效非洲爪蟾Vg-1（属于TGF-β超家族，通过将其与BMP2和激活素βB的原序列连接成功分泌），将小鼠GDF-9和人GDF-9 cDNA结合在一起ratBMP-2 和人激活素 βB cDNA 的前体部分当我们创建一个与 GDF-9 肽连接的构建体并将该表达载体导入 CV-1 细胞和 293 细胞时，在细胞质中发现了与抗 GDF-9 肽抗血清反应的产物，并且我们发现了一些克隆培养基上清液中存在与抗血清反应的物质，尽管含量很少。尽管仍然存在许多问题，例如改进检测系统，但我们相信根据这些结果，很有可能获得人和小鼠形式的活性 GDF-9 蛋白。