酢酸菌の制限酵素, 新しい酵素の開発とその分類学的側面

醋杆菌限制性内切酶、新酶的开发及其分类学方面

基本信息

批准号：
62560098
负责人：
山田雄三
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Shizuoka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-62560098/
关键词：
II型制限酵素 ApaLI ApaORI GceinI GceGLI Acetobacter pasteurianus Gluconobacter cerinus 酢酸菌

项目摘要

酢酸菌は組換えDNAの研究に有用な6塩基のパリンドロームを認識切断する多数の制限酵素を産生する. Acetobacter pasteurianus IFO13753の産生するII型制限酵素ApalIを本菌の無細胞抽出液よりストレプトマイシン処理, 硫安分画, ヘパリンーセファロースCL-6BおよびDEAE-セフアロースCL-6Bの各クロマトグラフィーおよびMonoQHR5/5を用いる高速液体クロマトグラフィーで, ポリアクリルアミド電気泳動的に単一にまで精製した. 精製酵素は入力NAを4か所で切断し, 24時間の酵素反応でも, その切断パターンに変化は見られなかった. 本酵素反応の至適条件は, 45°C, PH8.0, 7mMMgC1_2, 20mMNaClであった. しかし, NaClは0mMでも本酵素反応は充分に進行した. 本酵素の分子量はゲル濾過的に26,000, 等電点はアンホライン等電点電気泳動で4・8, クロマトフォーカシングで4.7であった. 本酵素の5分間のプレインキュベーションによる温度安定性では45°Cまで極めて安定であった. 本酵素のPH安定性は5.0〜8.0の間にあった. 本酵素はλ, Ad2, SV40, M13mp18RF, YbdintgX174RF, pBR322の各DNAを, それぞれ, 4, >6, 0, 1, 1, 3か所で切断した. YbdintgX-174RFDNAを本酵素で切断1, 5′末端を^<32>Pでラベルした後, Maxam-Gil-bert法で末端付近の塩基配列を決定した. その結果, 本酵素はDNAの塩基配列, 5′-GTGCAC-3′を特異的に認識し, そのGとTの間で切断する全く新しいII型制限酵素であることが解った. 本研究は他に, Acetobacter pasteurianus IFO13752のApa ORI, Gluconobacter cerinus IFO3260のGce inI, Gluconobacter cerinus IFO3285のGceGLIの各II型制限酵素を電気泳動的に単一にまで精製し, それらのDNA上における認識塩基配列およびその切断部位を決定した.

醋杆菌产生多种限制性内切酶，可识别和切割 6 碱基回文，可用于重组 DNA 的研究。巴氏醋杆菌 IFO13753 产生的 II 型限制性内切酶 ApalI 用来自该细菌无细胞提取物的链霉素处理。 , 硫酸铵级分,使用肝素-Sepharose CL-6B 和 DEAE-Sepharose CL-6B 色谱法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳以及使用 MonoQHR5/5 的高效液相色谱法纯化酶，即使在酶促反应 24 小时后，也未观察到裂解模式的变化。该酶促反应的最佳条件是 45°C， pH为8.0、7mMgCl_2和20mMNaCl。然而，即使使用0mM NaCl，酶反应也能令人满意地进行。通过凝胶过滤测定该酶的分子量为26,000，其等电点为4.8和色谱聚焦中的4.7。预孵育 5 分钟后，该酶的温度稳定性在高达 45°C 的温度下极其稳定。该酶的 pH 稳定性在 5.0 和 8.0 之间，用该酶 1 切割 YbdintgX-174RFDNA，用^<32>P标记5'端后，使用Maxam-Gil-bert方法确定了靠近末端的碱基序列。结果，该酶特异性识别了DNA碱基序列5'-GTGCAC-3'。结果发现，这是一种全新的II型限制性内切酶，可识别。将来自蜡葡菌IFO3260的II型限制性内切酶Gce inI和来自蜡葡菌IFO3285的GceGLI通过电泳纯化为单一型，并确定它们的识别碱基序列和DNA上的切割位点。