遺伝子工学によるリゾチームの酵素機能の徹底的解明と機能変換

通过基因工程彻底阐明溶菌酶的酶功能并进行功能转换

基本信息

批准号：
62220025
负责人：
堀内忠郎
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Special Project Research
财政年份：
1987
资助国家：
日本
起止时间：
1987 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ニワトリリゾチームに種々の変異を導入し, その機能の解明と交換を目的に以下の実験を行った. 前年度には大腸菌内で変異リゾチームを大量に発現させるシステム(菌体タンパク質の約25%), および変性状態で得られる変異リゾチームを活性構造に巻き戻すためのグルタチオンの酸化還元システムを確立した. しかしこの巻戻しシステムはAla31→Va1の変異リゾチームが巻戻らず, また試薬が高価で大量の巻戻しには不都合なものであった. 本年度は(1)巻戻しシステムの改良を行い, グルタチオンよりはるかに安価なメルカプトエタノールを用いる大量巻戻しシステムの開発に成功した. またグルタチオンのシステムに1M尿素を加えることで上記変異リゾチームを約30%の収率で巻戻すことにも成功した. (2)リゾチームの触媒基がGlu35とAsp52であることはすでに報告したが, さらにこれらのカルボキシル基の位置関係の重要性を調べるためにGlu35→Asp, Asp52→Gluおよび両方同時に置換した変異リゾチームを調製し, それらの性質を調べたところ, 活性はいずれも誤差の範囲で認められなかった. またGlu35を性質の似ているヒスチジンで置換した場合も活性がほとんど認められなかった. これらの結果よりGlu35およびAsp52の機能は他の類似のアミノ酸では代用できないと結論した. しかし活性部位にあるもう一つのカルボキシル基であるAsp101をリジンで置換しても活性は低下しなかった. (3)(2)で調製した変異リゾチームは酸性プロテアーゼおよびセリンプロテアーゼへの機能変換をも目指したものなので, まずそれらのエステラーゼ活性を調べるためにリゾチームの触媒基の近傍に結合できるエステル基質をいくつかデザインし合成した. 大量に変異リゾチームが調製でき次第それらのエステラーゼ活性を測定する予定である.

将各种变体引入了Niwat Riza Riza团队，并进行以下实验，以阐明和交换功能，该系统在Escherichia Coli中表示大量突变资源（约25％细菌蛋白质）和谷胱甘肽的还原系统已建立，以倒入退化的liza团队在这个财政年度，倒带系统得到了改善，使用Mercaputtanol的大规模倒带系统比谷胱甘肽更便宜。为了研究位置关系的重要性，我们准备了与GLU35→ASP，ASP52→GLU同时保留的变体，并检查了这些属性的性质，但在误差中没有识别活动从这些结果中，我们的活动几乎没有活性。赖氨酸的赖氨酸没有降低（3）（2），因为为了检查酯酶的活动，准备将功能转换为酸性蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的目的。并合成几个可以在蜥蜴团队的催化群体附近结合的酯底物。