シトクロムP450camオペロン・リプレッサー(CamR蛋白質)の構造と機能解析

细胞色素 P450cam 操纵子阻遏蛋白（CamR 蛋白）的结构和功能分析

• 批准号: 04254104
• 负责人: 堀内 忠郎
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Soka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04254104/
• 关键词: シトクロームP450cam; リプレッサー; DNA結合; カンファー

CamR蛋白質は、カンファー分解菌であるPseudomonas putida PpG1(ATCC17453)株のCAMプラスミド由来のリプレッサー蛋白質であり、シトクロムP-450camオペロン(camDCAB)の発現を制御する。また、このリプレッサーはcamDCABオペロンおよびcamR遺伝子も自己調節し、CamR蛋白質が一ケ所に結合することにより、camDCABオペロンおよびcamR遺伝子の転写を同時に抑制する。また、カンファー存在下ではリプレッサーは不活化され、それぞれの転写開始点から逆方向に両遺伝子群が発現される。以上のような特異的な性質を持つCamRリプレッサーの構造および機能解析を研究の目的とした。本年度は、CamR蛋白質の生化学的性質と立体構造(X線)の解明を中心に研究を行なった。CamR蛋白質の機能ドメインの解析は第3班の郷通子博士(名古屋大・理)と共同で行なった。CamR蛋白質のモジュール予測では、アミノ酸配列のN末から14-33番目(領域I)および40-59番目(領域II)の領域がDNA結合ドメインである可能性があった。このモジュールの結果を基に、二つの領域のアミノ酸を一つずつ変異させたCamR蛋白質を多数作製した。それぞれの変異CamR蛋白質のDNA結合能を測定した結果、領域Iの後半部分および領域IIの前半部分がDNA結合に重要であることがわかった。さらに、CamR蛋白質の基質(カンファー)結合部位のアミノ酸配列の特定とともに、リプレッサーの機能とそのアロステリズムを検討中である。また、CamR蛋白質の立体構造を解析するため、この蛋白質の結晶化を第3班の白木原康雄博士(兵庫教育大)と共同で進めており、やや大きな結晶を得ることが可能になった。

CAMR蛋白是一种源自樟脑细菌的CAM质粒，假单胞菌PPG1（ATCC17453）的抑制剂蛋白，并调节细胞色素P-450CAM操纵子（CAMDCAB）的表达。阻遏物还可以自动调节CAMDCAB操纵子和CAMR基因，并通过在一个地方与CAMR蛋白结合，同时抑制CAMDCAB操纵子和CAMR基因的转录。此外，在存在樟脑的情况下，阻遏物被灭活，并且两个基因组均与每个转录起点相反的方向表达。该研究的目的是分析具有上述特定特性的CAMR阻遏物的结构和功能。今年，我们进行了研究，重点是阐明CAMR蛋白的生化特性和三维结构（X射线）。 CAMR蛋白功能领域的分析是与第三组的Go Michiko（科学科学）Go Michiko博士合作进行的。 CAMR蛋白的模块化预测表明，来自氨基酸序列N端的区域14-33（I区）和40-59（区域II）可能是DNA结合域。基于该模块的结果，产生了大量CAMR蛋白，其中两个区域中的氨基酸被一个一个一个突变。测量了每个突变体CAMR蛋白的DNA结合能力，发现区域I和II区的下半部分的下半部分对于DNA结合很重要。此外，我们目前正在研究阻遏物及其变构的功能，同时识别CAMR蛋白的底物（营）结合位点的氨基酸序列。此外，为了分析CAMR蛋白的三维结构，我们一直在与第三个团队的Shirakihara Yasuo（Hyogo University of Education）合作进行这种蛋白质的结晶，从而可以获得稍大的晶体。