シトクロムP450camオペロン・リプレッサー(CamR蛋白質)の構造と機能解析

细胞色素 P450cam 操纵子阻遏蛋白（CamR 蛋白）的结构和功能分析

• 批准号: 04254104
• 负责人: 堀内 忠郎
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Soka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04254104/
• 关键词: シトクロームP450cam; リプレッサー; DNA結合; カンファー

CamR蛋白質は、カンファー分解菌であるPseudomonas putida PpG1(ATCC17453)株のCAMプラスミド由来のリプレッサー蛋白質であり、シトクロムP-450camオペロン(camDCAB)の発現を制御する。また、このリプレッサーはcamDCABオペロンおよびcamR遺伝子も自己調節し、CamR蛋白質が一ケ所に結合することにより、camDCABオペロンおよびcamR遺伝子の転写を同時に抑制する。また、カンファー存在下ではリプレッサーは不活化され、それぞれの転写開始点から逆方向に両遺伝子群が発現される。以上のような特異的な性質を持つCamRリプレッサーの構造および機能解析を研究の目的とした。本年度は、CamR蛋白質の生化学的性質と立体構造(X線)の解明を中心に研究を行なった。CamR蛋白質の機能ドメインの解析は第3班の郷通子博士(名古屋大・理)と共同で行なった。CamR蛋白質のモジュール予測では、アミノ酸配列のN末から14-33番目(領域I)および40-59番目(領域II)の領域がDNA結合ドメインである可能性があった。このモジュールの結果を基に、二つの領域のアミノ酸を一つずつ変異させたCamR蛋白質を多数作製した。それぞれの変異CamR蛋白質のDNA結合能を測定した結果、領域Iの後半部分および領域IIの前半部分がDNA結合に重要であることがわかった。さらに、CamR蛋白質の基質(カンファー)結合部位のアミノ酸配列の特定とともに、リプレッサーの機能とそのアロステリズムを検討中である。また、CamR蛋白質の立体構造を解析するため、この蛋白質の結晶化を第3班の白木原康雄博士(兵庫教育大)と共同で進めており、やや大きな結晶を得ることが可能になった。

CamR蛋白是源自樟脑降解菌恶臭假单胞菌PpG1 (ATCC17453)菌株的CAM质粒的阻遏蛋白，并控制细胞色素P-450 cam操纵子(camDCAB)的表达。该阻遏蛋白还自动调节 camDCAB 操纵子和 camR 基因，并通过将 CamR 蛋白结合到单个位点，同时抑制 camDCAB 操纵子和 camR 基因的转录。此外，在樟脑存在下，阻遏蛋白失活，并且两个基因组从各自的转录起始位点以相反的方向表达。本研究的目的是分析具有上述独特性质的CamR阻遏蛋白的结构和功能。今年，我们的研究重点是阐明 CamR 蛋白的生化特性和三维结构（X 射线）。与第三组的 Michiko Go 博士（名古屋大学理学院）合作分析了 CamR 蛋白的功能域。根据CamR蛋白的模块预测，氨基酸序列N端起第14至33个（I区）和第40至59个（II区）区域可能是DNA结合域。基于该模块的结果，我们创建了许多 CamR 蛋白，其中两个区域各有一个氨基酸发生突变。测定各突变型CamR蛋白的DNA结合能力的结果发现，I区的后半部和II区的前半部对于DNA结合很重要。此外，我们目前正在鉴定CamR蛋白底物（樟脑）结合位点的氨基酸序列，并正在研究阻遏蛋白的功能及其变构作用。另外，为了分析CamR蛋白的三维结构，我们正在与第三团队的Yasuo Shirakihara博士（兵库教育大学）合作对该蛋白进行结晶，目前我们已经能够获得稍大一些的晶体。