小児骨系統疾患の病態解明を目指した疾患特異的ヒトiPS細胞の骨分化誘導法の確立

建立诱导疾病特异性人 iPS 细胞成骨分化的方法，旨在阐明儿童骨疾病的病理学

• 批准号: 15K19612
• 负责人: 藤原 誠
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15K19612/
• 关键词: 疾患iPS細胞由来骨芽細胞; 骨形成不全症; コラーゲン過修飾; コラーゲン蓄積; 小胞体ストレス; 骨芽細胞; 骨細胞

平成28年度までに以下の成果を得た。①骨形成不全症患者6症例から皮膚線維芽細胞を採取し（以下疾患線維細胞）、うち5症例でセンダイウイルスベクターを用いてiPDS細胞を樹立した（以下疾患iPS細胞）。健常あるいは疾患iPS細胞から神経堤細胞に分化誘導し、表面マーカーであるCD271/p75を用いてFACSにて選別し、さらにbFGF添加培養液を用いることで間葉系幹細胞に分化させ得た。②健常また疾患間葉系幹細胞について骨分化培養を6週間行い、石灰化をAlizarin red染色で確認した。③健常また疾患間葉系幹細胞の培養上清からコラーゲンを抽出し、SDS-PAGEにて過修飾を受けた変異コラーゲンを確認する方法を確立した。グリシン置換変異では、コラーゲンの泳動の遅れが確認された一方で、エクソンスキップ変異やナンセンス変異では泳動の遅れは認めなかった。またＩ型コラーゲンの翻訳後修飾についてLC/MSを行い、グリシン置換変異のＩ型コラーゲンでは糖鎖の過修飾が行われていることを認めた。更に、健常または疾患線維芽細胞のＩ型コラーゲンの細胞蛍光免疫染色にて、グリシン置換変異とエクソンスキップ変異では、小胞体内へのＩ型コラーゲンの蓄積が見られた一方で、ナンセンス変異では蓄積は認めなかった。④健常または疾患線維芽細胞におけるERストレスマーカー遺伝子の発現をRT-PCRで検討したところ、BiP遺伝子の発現が骨形成不全症の全例で健常と比し約2倍に上昇していることを確認した。

到2016财年，取得了以下结果：1）从六名成骨不足的患者（以下称为疾病纤维细胞）中收集了皮肤成纤维细胞，其中5例中，IPDS细胞是使用Sendai病毒载体建立的（以下称为疾病IPS IPS IPS IPS）。从健康或患病的IPS细胞中诱导分化为神经rest细胞，并使用表面标记CD271/p75对FACS进行分类，然后使用补充BFGF的培养基通过培养基分化为间充质干细胞。 2）将健康和患病的间充质干细胞培养6周，并通过艾丽莎白红染色确认钙化。 3）已经建立了一种方法来从健康和患病的间充质干细胞的培养上清液中提取胶原蛋白，并确认已被SDS-PAGE过度修饰的突变胶原蛋白。尽管甘氨酸取代突变证实了胶原蛋白迁移的延迟，但外显子跳过或胡说八道突变并未显示出迁移的延迟。此外，LC/MS进行了I型胶原蛋白的翻译后修饰，发现聚糖过度修饰是在具有甘氨酸取代突变的I型胶原蛋白中进行的。此外，健康或疾病成纤维细胞的细胞荧光免疫染色表明，内质网中发生了I型胶原蛋白在甘氨酸取代突变中的积累，外显子跳过突变发生，而无意义的突变则没有累积。 ④当使用RT-PCR检查健康或疾病成纤维细胞中ER应力标记基因的表达时，证实BIP基因的表达在所有成骨的IMPECTA的情况下，与健康相比，BIP基因的表达大约是两倍。