足場非依存的な複製開始機構の解明

阐明不依赖锚定的复制启动机制

基本信息

批准号：
15024218
负责人：
山本華子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

S期開始因子であるCdc6は、足場の有無に応じてタンパクレベルで発現の制御を受けており、これが足場依存的なG1/S期制御の最終ターゲット因子であろうと考えられる。Cdb6は、G2/M期そして休止期においてはユビキチン分解系による制御を受けている。一方、G1期におけるCdc6発現の消失は、プロテアソームの特異的な阻害剤であるラクタシスチンでは阻害すること出来ず、システインプロテアーゼファミリーの特異的阻害剤ALLNによって抑制することが出来る。このことからG1期におけるCdc6の発現制御は、ユビキチン系とは別にシステインプロテアーゼファミリーに属する酵素が行っているものと考えられた。我々はまず同ファミリーの中でもカルパイン類に着目し、Cdc6の分解活性のカルシウム依存性の有無を検討した。その結果、in vitroで合成したCdc6を基質とし、これに浮遊培養条件に移したNRK細胞抽出液(分解酵素が活性化している)と共に濃度を変えたEGTA、EDTAを加えた場合も、また逆にカルシウム濃度を上げた場合にもCdc6の分解活性に変化はなかった。このことからNRK細胞内で見られるCdc6の分解はカルシウム依存的なカルパイン類に依るものではないと結論付けられた。次に同ファミリーに属するカテプシン類について検討を開始した。カテプシンはリソソームプロテアーゼの総称であり、基質特異性などによってアルファベットで分類されている。多くのカテプシン類の中から最も可能性の高い酵素を選ぶため、細胞抽出液に種々の阻害剤を加えてCdc6の分解状態を検討した。その結果、シスタチンCによってCdc6の分解は効果的に抑制された。シスタチンCはカテプシンB,F,H,L,Sに対して特異的に作用する。別の阻害剤の実験によってカテプシンBの可能性も削除出来たことから、残るカテプシン類が候補因子となる可能性が高いと考えられた。実際、この中の市販の精製タンパクが存在する幾つかは、in vitroでCdc6と直接反応させる実験においても、分解活性を持つことが確認された。

S 期起始因子 Cdc6 的表达根据支架的存在或不存在在蛋白质水平上受到调节，并且认为这是锚定依赖性 G1/S 期调节的最终目标因子。 Cdb6 在 G2/M 期和静息期受泛素降解系统调节。另一方面，G1期Cdc6表达的丧失不能被蛋白酶体特异性抑制剂lactacystin抑制，但可以被半胱氨酸蛋白酶家族特异性抑制剂ALLN抑制。这表明G1期Cdc6的表达受到属于半胱氨酸蛋白酶家族的酶的调节，与泛素系统分开。我们首先关注同一家族的钙蛋白酶，并研究 Cdc6 的降解活性是否依赖于钙。结果，当使用体外合成的Cdc6作为底物并添加不同浓度的EGTA和EDTA以及NRK细胞提取物（其中降解酶被激活）并转移至悬浮培养条件时，也出现了相反的效果。即使钙浓度增加，Cdc6 的降解活性也没有变化。由此得出结论，NRK 细胞中观察到的 Cdc6 降解不是由钙依赖性钙蛋白酶引起的。接下来，我们开始研究属于同一家族的组织蛋白酶。组织蛋白酶是溶酶体蛋白酶的总称，根据底物特异性按字母顺序分类。为了从众多组织蛋白酶中选择最有可能的酶，我们在细胞提取物中添加了各种抑制剂并检查了 Cdc6 的降解状态。结果，Cdc6的降解被胱抑素C有效抑制。胱抑素 C 特异性作用于组织蛋白酶 B、F、H、L 和 S。由于通过使用另一种抑制剂的实验消除了组织蛋白酶 B 的可能性，因此认为剩余的组织蛋白酶很可能是候选因子。事实上，其中一些市售纯化蛋白甚至在体外直接与 Cdc6 反应的实验中也被证实具有降解活性。