足場非依存的な複製開始機構の解明

阐明不依赖锚定的复制启动机制

基本信息

批准号：
16022219
负责人：
山本華子
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

線維芽細胞を含む間葉系細胞の増殖には、細胞外マトリックスを形成する"足場"が必要であり、これが無い状況下ではG1期に停止する。我々はこれまでに、S期開始因子であるCdc6が足場の有無に応じてタンパクレベルで発現の制御を受けることを見出しており、がん化に伴う足場非依存的増殖のメカニズムを解明の鍵であろうと考えている。Cdc6は、通常はユビキチン分解系による制御を受けているといわれている。近年我々は、上述のG1/S期におけるCdc6タンパクの発現制御には、通常のユビキチン系とは別のタンパク分解系が関与していることを見出した。種々の阻害剤を用いて検討を行った結果、足場依存的にCdc6タンパクの分解制御を担っているのはシステインプロテアーゼファミリーに属する酵素であり、その中でもカルシウム依存性の無いカテプシンであることが明らかになった。カテプシンはリソソームプロテアーゼの総称であり、活性部位、基質特異性、阻害剤との相互作用、分子量などによって分類されている。本年度、我々はNP-40を加えて小胞体等の細胞小器官を破壊したNRK細胞及びHela細胞の細胞抽出液中に強いCdc6分解活性が存在すること、このCdc6分解活性を示した細胞抽出液中にはカテプシンLやBの発現することを確認した。更にCdc6の分解はシスタチンCによって効果的に抑制されCA-074-MEでは抑制されないことも明らかにし、カテプシンBではなくカテプシンLとその類似酵素がCdc6タンパク発現の制御因子である可能性が高いと結論付けるに至った。In vivoと同時に精製酵素を用いたin vitroの分解実験においても同様の結果となることを確認し、カテプシンLに加えてカテプシンL類縁酵素であるカテプシンK, VらもCdc6タンパクの分解活性を有することを明らかにしている。現在はCdc6の制御領域の特定に着手しており、分解制御を受けない変異型Cdc6の構築とその発現株の樹立を進めている。

包括成纤维细胞在内的间充质细胞的增殖需要一个形成细胞外基质的“支架”，如果没有这个“支架”，细胞就会停滞在G1期。我们之前发现，S期起始因子Cdc6的表达在蛋白质水平上受到支架是否存在的调节，这可能是阐明与癌变相关的锚定非依赖性增殖机制的关键。我想是的。据说 Cdc6 通常受到泛素降解系统的调节。最近，我们发现除了正常泛素系统之外还有一个蛋白水解系统参与了上述G1/S期Cdc6蛋白表达的调节。使用各种抑制剂的研究结果表明，属于半胱氨酸蛋白酶家族的酶负责以锚定依赖性方式控制Cdc6蛋白的降解，并且在这些酶中，组织蛋白酶不依赖于钙。它变成了。组织蛋白酶是溶酶体蛋白酶的总称，根据活性位点、底物特异性、与抑制剂的相互作用、分子量等进行分类。今年，我们发现，通过添加NP-40，内质网等细胞器被破坏的NRK细胞和Hela细胞的细胞提取物中存在很强的Cdc6降解活性，并且显示出这种Cdc6降解活性的细胞提取物是证实组织蛋白酶 L 和 B 在其中一些细胞中表达。此外，我们发现Cdc6降解被半胱氨酸蛋白酶抑制剂C有效抑制，但不被CA-074-ME抑制，这表明组织蛋白酶L及其类似酶，而不是组织蛋白酶B，可能是Cdc6蛋白表达的调节因子。得出结论。我们证实，在使用纯化酶的体外降解实验中以及在体内获得了类似的结果，并且除了组织蛋白酶L之外，组织蛋白酶K和V（组织蛋白酶L相关酶）也具有Cdc6蛋白降解活性。很明显。我们目前正在鉴定Cdc6的调控区域，并正在进行不受降解控制的突变体Cdc6的构建以及表达它的菌株的建立。