リン脂質を認識するタンパク質の脂質二重膜における配向に関する構造生物学的研究

识别脂质双层膜中磷脂的蛋白质取向的结构生物学研究

基本信息

批准号：
15013218
负责人：
寺沢宏明
金额：
$ 2.94万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、リガンド脂質を認識し脂質二重膜に直接相互作用するタンパク質が、本来の姿で相互作用し機能する様子を正確に決定する方法の開発を目的とする。当研究室の開発した、NMRを用いた転移交差飽和法によるタンパク質複合体相互作用界面決定法は、不均一な巨大分子との相互作用解析を可能とした。転移交差飽和法を、NADPHオキシダーゼに存在するp47PXドメインと、そのリガンドであるホスファチジルイノシトール(3,4)2リン酸(以下PI(3,4)P2と表記する)を含むリポソームとの相互作用解析に適用して検討を進めている。まず、p47 PXドメインの発現・精製系を確立して安定同位体標識タンパク質を取得し、三重共鳴NMRの測定とアミノ酸選択的標識による主鎖連鎖帰属を終了した。次に、p47 PXドメインにおけるPI(3,4)P2含有リポソームとの相互作用部位を転移交差飽和法に基づいて同定した。明らかになった相互作用部位は、変異体と表面プラズモン法のみを用いたWilliams RLらのグループの結果とは全く異なった部位であった。さらに、Williamsらはホスファチジン酸結合部位を示しているが、我々の結果では、ホスファチジン酸の結合はPI(3,4)P2に比較して非常に弱く、PI(3,4)P2存在下ではp47 PXドメインとは相互作用しない。また、他のPXドメインにおいて、detergentを用いた結合実験によって示されたmembmne insertion loopは、p47 PXドメインにおいてはリポソームとの相互作用が観測されなかった。データ精度の向上と変異体を用いた検討をさらに進めている。

本研究的目的是开发一种方法来准确确定识别配体脂质并直接与脂质双层膜相互作用的蛋白质在其原始状态下如何相互作用和发挥作用。我们实验室开发的利用核磁共振转移交叉饱和法的蛋白质复合物相互作用界面测定方法使得分析与异质大分子的相互作用成为可能。易位交叉饱和法与含有NADPH氧化酶中存在的p47PX结构域及其配体磷脂酰肌醇(3,4)二磷酸(以下简称PI(3,4)P2)的脂质体的相互作用分析我们目前正在考虑应用该方法。到首先，我们建立了p47 PX结构域的表达和纯化系统，获得了稳定的同位素标记蛋白，并利用氨基酸选择性标记完成了三重共振NMR测量和主链分配。接下来，基于转移交叉饱和法鉴定了p47 PX结构域中与含有PI(3,4)P2的脂质体的相互作用位点。揭示的相互作用位点与Williams RL等人小组的结果完全不同，该小组仅使用突变体和表面等离子体方法。此外，尽管 Williams 等人显示了磷脂酸结合位点，但我们的结果表明，与 PI(3,4)P2 相比，磷脂酸结合非常弱，并且在 PI(3,4)P2 存在的情况下不会发生相互作用。具有 p47 PX 结构域。此外，在其他 PX 结构域中，通过使用去污剂的结合实验显示的膜插入环未观察到与 p47 PX 结构域中的脂质体相互作用。我们正在继续提高数据准确性并利用突变体进行研究。