CD44の糖鎖認識とシグナル伝達制御に関する構造生物学的研究

CD44碳水化合物识别与信号转导控制的结构生物学研究

基本信息

批准号：
17046003
负责人：
寺沢宏明
金额：
$ 3.33万
依托单位：
Kumamoto University (2006)The University of Tokyo (2005)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞の遊走機構を理解する上で、主要な細胞接着分子であるCD44と細胞外マトリックスの主要成分であるヒアルロン酸(Hyaluronic acid ; HA)やコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(PG)との相互作用を構造生物学的に解明することは重要である。本特定領域研究において、CD44のヒアルロン酸結合ドメイン(HA-binding domain ; HABD)の二次構造とHA結合部位を同定した。さらにHA結合に伴い、HA結合部位と異なる部位に構造変化が誘起されることを示した。次に、HA結合状態でのCD44 HABDの立体構造を決定した。その結果、リガンド非結合状態に比較して、CD44のC末端領域がランダム様に構造変化することを明らかにした。CD44は、低分子量HAの添加により、細胞外領域においてプロテアーゼによる切断が誘導されることが示されている。HA結合によるC末端領域のランダム様への構造変化とプロテアーゼによる切断との相関を調べるため、in vitroにおけるCD44のトリプシン分解を試みた。その結果、リガンド非結合状態に比較して、HA結合状態においてC末端領域における分解速度の亢進が見られた。さらに、HABDの立体構造に基づき、C末端領域の高次構造保持に重要と考えられるアミノ酸残基に変異を導入した。変異体のHA結合能を測定した結果、野生型と比較し、高い結合活性を有することを明らかにした。変異体はHA非存在下においてもC末端領域がランダム構造をとることがわかった。野生型において構造多型に由来する2組(major, minor)のNMRピークが検出され、minorピークのスペクトルパターンが変異体とほぼ一致することを明らかとした。以上の結果は、CD44が2状態間の平衡を有し、低分子量HAの結合に伴い、プロテアーゼ感受性が高い立体構造へと移行することを示唆する。

为了了解细胞迁移机制，我们利用结构生物学研究了主要细胞粘附分子 CD44 与细胞外基质的主要成分透明质酸 (HA) 和硫酸软骨素蛋白聚糖 (PG) 之间的相互作用。重要的是要澄清在这项特定领域研究中，我们鉴定了 CD44 透明质酸结合域 (HABD) 的二级结构和 HA 结合位点。此外，我们发现HA结合会诱导与HA结合位点不同的位点发生结构变化。接下来，我们确定了HA结合状态下CD44 HABD的三维结构。结果表明，与未配体状态相比，CD44 的 C 末端区域经历了随机结构变化。已经表明，添加低分子量 HA 会诱导细胞外区域 CD44 的蛋白酶裂解。为了研究由于 HA 结合和蛋白酶切割导致的 C 末端区域随机结构变化之间的相关性，我们尝试在体外用胰蛋白酶降解 CD44。结果，与非配体结合状态相比，在HA结合状态下观察到C末端区域的降解速率加快。此外，基于HABD的三维结构，将突变引入到被认为对于维持C末端区域的高级结构重要的氨基酸残基中。测定突变体的透明质酸结合能力的结果表明，其与野生型相比具有更高的结合活性。研究发现，即使在没有HA的情况下，突变体的C端区域也采用随机结构。在野生型中检测到源自结构多态性的两组 NMR 峰（主峰和次峰），并且发现次峰的光谱模式与突变体的光谱模式几乎相同。上述结果表明CD44在两种状态之间具有平衡，并且在与低分子量透明质酸结合后，其转变为对蛋白酶高度敏感的构象。