NMRを用いた膜蛋白質-蛋白質相互作用における結合部位決定法の確立とその応用

核磁共振确定膜蛋白-蛋白相互作用结合位点方法的建立及其应用

• 批准号: 03J11378
• 负责人: 竹内 恒
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J11378/
• 关键词: nuclear Magnetic Resonance; K+チャネル; ポアーブロッカー; 転移交差飽和法; Nuclear Magnetic Resonance; K^+チャネル; 転移交差飽和(TCS)法

細胞表面に存在する膜蛋白質と細胞内外のリガンドの結合は、膜を介した情報伝達において重要な役割を果たしており、その生化学的意義を明らかにする上で、構造生物学的手法を導入し、リガンドの膜蛋白質結合部位を正確に同定することは有効と考えられる。しかしながら、膜蛋白質は脂質二重膜以外の環境において高次構造的に不安定となることが一般的に知られているため、界面活性剤に可溶化して解析を行う従来の構造生物学的戦略は常に有効とはいえなかった。そこでより汎用性の高い手法の確率を目指し、脂質二重膜中で膜蛋白質とリガンドの相互作用解析を行うNMR手法の確立を行った。解析対象としては、昨年度、転移交差飽和法により結合界面を決定したStreptmyces lividance由来のK^+チャネル:KcsAと、K^+チャネルのポア領域に結合しイオンの透過を妨げるサソリ毒液由来のペプチド:Agitoxin2(AgTx)の相互作用を選択した。まずKcsAをアフィニティービーズに固定化した上で周囲に脂質二重膜を形成させることで、KcsAを脂質二重膜中に安定に再構成することに成功した。ここで確立した再構成手法は、使用するアフィニティービーズの種類や再構成する脂質の種類を選択することでKcsA以外の様々な膜蛋白質に適用可能であり、汎用性が高い。さらにKcsA再構成ビーズとAgTxの複合体に転移交差飽和法を適用し、AgTxのKcsA結合面を再現することに成功した。これは、脂質二重膜中の膜蛋白質に対するリガンドの相互作用面を観測した世界で初めての例である。

存在于细胞表面的膜蛋白与细胞内外的配体之间的结合在通过膜的信息传递中起着重要作用，我们引入结构生物学方法来阐明其生化意义，被认为可以有效地准确识别。配体的膜蛋白结合位点。然而，众所周知，膜蛋白在脂双层膜以外的环境中会变得构象不稳定，因此将膜蛋白溶解在表面活性剂中并进行分析的传统结构生物学方法并不总是有效。因此，为了寻求一种更通用的方法，我们建立了一种核磁共振方法来分析脂双层膜中膜蛋白和配体之间的相互作用。分析的对象是去年使用转移交叉饱和法确定了结合界面的来自浅青链霉菌的K^+通道KcsA，以及与K^+通道的孔区域结合的来自蝎毒的肽并防止离子渗透：我们选择了 Agitoxin2 (AgTx) 的相互作用。首先，通过将 KcsA 固定在亲和珠上并在其周围形成脂质双层，他们成功地将 KcsA 稳定地重构为脂质双层。这里建立的重构方法具有高度通用性，因为通过选择所使用的亲和珠的类型和要重构的脂质的类型，它可以应用于除 KcsA 之外的各种膜蛋白。此外，我们将转移交叉饱和方法应用于KcsA重组珠和AgTx的复合物，并成功再现了AgTx的KcsA结合表面。这是世界上第一个观察配体表面与脂质双层膜中膜蛋白相互作用的例子。

项目成果

イオンチャネル阻害ペプチドによるチャネル阻害機構の構造解析:NMR法を用いて

离子通道抑制肽的通道抑制机制的结构分析：使用NMR方法

• 期刊: 蛋白質 核酸 酵素 (発表予定)
• 作者: 竹内 恒;嶋田 一夫
• 通讯作者: 嶋田 一夫

Takeuchi, K., Yokogawa, M., Matsuda, T., Sugai, M., et al.: "Structural basis of the KcsA K+ channel and Agitoxin 2 pore-blocking toxin interaction by using the transferred cross-saturation method."Structure. 11. 1381-1392 (2003)

Takeuchi, K.、Yokokawa, M.、Matsuda, T.、Sugai, M.等人：“使用转移交叉饱和法研究 KcsA K 通道和 Agitoxin 2 孔阻塞毒素相互作用的结构基础。”