多剤耐性転写制御因子の動的薬剤認識と機能発現のＮＭＲ解析

多药耐药转录调节因子的动态药物识别和功能表达的NMR分析

• 批准号: 26713003
• 负责人: 竹内 恒
• 金额: $ 3.49万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-26713003/
• 关键词: 多剤耐性; 構造生物学; 溶液NMR法; 動的立体構造解析

本研究においては原核生物の多剤耐性トランスポーターの発現を担う多剤耐性転写因子が、様々な薬剤を認識し、転写制御を行う機構を、NMR 法を用いた動的立体構造解析により明らかにした。多剤耐性転写因子としてはPadRファミリーに属し、Lactococcus lactisの主要な多剤耐性機構を担うLmrRを対象とした。溶液NMR法を用いた運動性解析の結果、LmrRが非結合状態においても薬剤結合部位にus-nsの運動性を有することを見出した。またメチル化学シフト解析の結果、非結合状態においてはa4ヘリックスが開構造から閉構造の広い構造的平衡を示す一方、薬剤の結合に伴って、異なる度合いで閉方向に構造平衡が傾くことが明らかとなった。すなわちLmrRは薬剤の構造に合わせてa4ヘリックスの構造平衡を柔軟に変化させることで、様々な薬剤に対する結合を達成する。またメチル緩和解析により薬剤結合前後でのLmrR内部の運動性変化を比較すると、薬剤結合後にはむしろ遠位での構造的柔軟性が向上しており、その度合いから導き出される構造エントロピーは分子全体では増大していた。このことはLmrRが運動性の再配分を行うことで、薬剤への結合強度を構造エントロピーを介して向上させていることを示している。等温滴定型熱量計を用いた熱力学的解析を行った結果、LmrRの薬剤認識がエントロピー駆動型であり、NMR法から得られる知見と合致した。またLmrRはDNA結合に伴い、a4ヘリックスの構造平衡を薬剤とは逆向きに傾かせる。a4ヘリックスの構造はDNA結合ヘリックス間の距離と相関していることから、薬剤結合時にはDNAと結合しにくい構造にヘリックス間距離が分布していることとなる。このことが薬剤結合に伴うDNA親和性の低下を誘起すると考えられた。以上の知見はNMRを用いた動的構造解析により初めて明らかとなったものであり、多剤耐性システムの制御に重要な示唆を与えるものである。

在本研究中，我们通过使用NMR方法的动态3D结构分析阐明了负责在原核生物中表达多药耐药转运蛋白的多药耐药转录因子识别各种药物并调节转录的机制。作为多药耐药转录因子，我们靶向 LmrR，它属于 PadR 家族，负责乳酸乳球菌的主要多药耐药机制。使用溶液核磁共振进行运动分析的结果，我们发现即使在未结合状态下，LmrR 在药物结合位点也具有 us-ns 运动。此外，甲基化学位移分析的结果表明，虽然a4螺旋在未结合状态下表现出从开放结构到闭合结构的广泛结构平衡，但在药物结合后结构平衡不同程度地向闭合方向倾斜。也就是说，LmrR通过根据药物结构灵活改变a4螺旋的结构平衡来实现与多种药物的结合。此外，当我们利用甲基弛豫分析比较药物结合前后LmrR内部迁移率的变化时，我们发现药物结合后，远端的结构柔性得到了相当程度的改善，由此得出的结构熵为它正在增加。这表明 LmrR 通过结构熵重新分配运动性以提高与药物的结合强度。使用等温滴定量热计的热力学分析表明，LmrR 药物识别是熵驱动的，与 NMR 方法的结果一致。此外，在与 DNA 结合后，LmrR 使 a4 螺旋的结构平衡向与药物相反的方向倾斜。由于a4螺旋的结构与DNA结合螺旋之间的距离相关，因此螺旋之间的距离分布在药物结合时难以与DNA结合的结构中。这被认为会导致与药物结合相关的 DNA 亲和力降低。上述发现首次通过核磁共振动态结构分析揭示，为控制多药耐药系统提供了重要启示。

项目成果

NMR法により明らかとなるタンパク質複合体の機能的運動性

NMR 方法揭示蛋白质复合物的功能运动

• 发表时间: 2014
• 期刊: BULLETIN OF THE NUCLEAR MAGNETIC RESONANCE SOCIET Y OF JAPAN
• 作者: 竹内 恒;嶋田 一夫
• 通讯作者: 嶋田 一夫

Functional dynamics of cell surface membrane proteins.

• DOI: 10.1016/j.jmr.2013.11.007
• 发表时间: 2014-04
• 期刊: Journal of magnetic resonance
• 影响因子: 2.2
• 作者: N. Nishida;M. Osawa;K. Takeuchi;Shunsuke Imai;P. Stampoulis;Yutaka Kofuku;Takumi Ueda;I. Shimada

多剤耐性転写制御因子LmrRの運動性と多剤薬剤認識機構のNMR解析

多药耐药转录调节因子LmrR的运动性和多药识别机制的NMR分析

• 发表时间: 2014
• 作者: 竹内 恒;嶋田 一夫
• 通讯作者: 嶋田 一夫

Dynamic multidrug recognition by multidrug transcriptional repressor LmrR from Lactococcus lactis

乳酸乳球菌多药转录阻遏蛋白 LmrR 的动态多药识别

• 发表时间: 2014
• 作者: 鷹林 将;林 広幸;楊 猛;小川 修一;尾辻 泰一;高桑 雄二;K. Kuwada;Koh Takeuchi and Ichio Shimada.
• 通讯作者: Koh Takeuchi and Ichio Shimada.