新規安定同位体ラベル法を用いた高分子量創薬ターゲット蛋白質の構造機能解析法の開発

使用新型稳定同位素标记方法开发高分子量药物发现靶蛋白的结构功能分析方法

• 批准号: 22890246
• 负责人: 竹内 恒
• 金额: $ 2.01万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22890246/
• 关键词: 核磁気共鳴法; 安定同立体標識; 連鎖帰属; ピルビン酸; ^<13>C-^<12>C交互標識

^<13>C標識に用いられるグルコースに替わりアミノ酸前駆体である2-^<13>Cピルビン酸を用いた"^<13>C-^<12>C交互標識法"と、^<13>Cα-^<13>Cα間を直接相関付ける□CACA-TOCSY"を組み合わせた新たな水素核3重共鳴測定法:hnCA-TOCSY-caNH(以下大文字が化学シフト相関を得る核種、小文字が磁化の移動にのみ用いる核種とする)を開発した。本手法は、一般的に主鎖帰属に用いられるHNCA実験と同様にC^α核の化学シフトを利用して連鎖帰属を行うものであるが、各HN(i)につきCa(i-1)に対してのみ連鎖帰属情報が含まれるHNCA実験に比べ、hnCA-TOCSY-caNH実験ではCa(i-2),Ca(i-1),Ca(i+1)と3組の連鎖帰属情報が含まれることから、シグナルの縮重が激しい高分子量蛋白質の帰属において有効な手法となる。またCa(i-2)、Ca(i+1)への連鎖相関は、他の手法で得ることのできないユニークな帰属情報であり本手法の独創性は高いと考える。これと同時にhNca-TOCS-caNH,Hnca-TOCSY-caNHを開発し、HN(i)に対しi-2からi+2の窒素核あるいは水素核同士を直接相関付ける測定法の確立も行った。本測定は従来法であるhNcacoNH実験,hNcaNH実験などと比較してより多くの連鎖相関を含んでおり、他の手法で得ることのできないユニークな連鎖相関を与える点で上述のhnCA-TOCSY-caNHと同様に重要な測定法になると考られる。さらに上述の本手法をより高分子量の高分子量蛋白質へ適用できるようにするためにはさらに高度な重水素化が必要であると考え、ピルビン酸の3位メチルプロトンを重水素化する新たな手法を確立した。

“^<13>C-^<12>C交替标记法”使用氨基酸前体2-^<13>C丙酮酸代替用于^<13>C标记的葡萄糖，并且^<13>之间的直接相关性>Cα-^<13>Cα结合□CACA-TOCSY：hnCA-TOCSY-caNH（大写字母表示获得化学位移相关性的核素，小写字母表示仅用于磁化转移的核素）开发了一种新的氢核三重共振测量方法。该方法利用C^α核的化学位移进行链分配，类似于常用的主链分配HNCA实验，但对于每个HN(i)，仅包含Ca(i-Chain归属信息1)与HNCA实验相比，hnCA-TOCSY-caNH实验包含三组链分配信息：Ca(i-2)、Ca(i-1)和Ca(i+1)，因此信号的简并性为高分子量蛋白质的归属减少。另外，与Ca(i-2)和Ca(i+1)的连锁相关性是使用其他方法无法获得的独特属性信息，并且该方法具有高度原创性。我们开发了caNH,Hnca-TOCSY-caNH，并建立了一种直接关联从i-2到i+2的氮核或氢核的测量方法，用于hNcacoNH实验，它被认为是类似于上述hnCA-TOCSY-caNH的重要测量方法，因为它比hNcaNH实验包含更多的连锁相关性，并且提供了其他方法等无法获得的独特连锁相关性。此外，为了将上述方法应用于较高分子量的蛋白质，我们认为需要更高程度的氘化，并且我们开发了一种对丙酮酸的3位甲基质子进行氘化的新方法我们建立了一种新方法。 。

项目成果

CACA-TOCSY with alternate ^<13>C-^<12>C labeling : a ^<13>C^α direct detection experiment for mainchain resonance assignment, dihedral angle information, and amino acid type identification

具有交替 ^<13>C-^<12>C 标记的 CACA-TOCSY：用于主链共振分配、二面角信息和氨基酸类型识别的 ^<13>C^α 直接检测实验

• 发表时间: 2010
• 期刊: J Biomol NMR
• 影响因子: 2.7
• 作者: Takeuchi K;Frueh D;Sun ZY;Hiller S;Wagner G
• 通讯作者: Wagner G

高分子量蛋白質のNMR解析に適した13C標識法および測定法の開発

开发适用于高分子量蛋白质NMR分析的13C标记方法和测量方法

• 发表时间: 2011
• 作者: Shigeyoshi Saito;Sumitaka Hasegawa;Takako Furukawa;TetsuyaSuhara;Iwao Kanno;Ichio Aoki.;末永雄介;竹内恒
• 通讯作者: 竹内恒

NMR analyses of the G{beta}{gamma} binding and conformational rearrangements of the cytoplasmic pore of G protein-activated inwardly rectifying potassium channel 1 (GIRK1).

G 蛋白激活的内向整流钾通道 1 (GIRK1) 细胞质孔的 G{beta}{gamma} 结合和构象重排的 NMR 分析。

• 发表时间: 2010
• 期刊: J Biol Chem
• 影响因子: 4.8
• 作者: Yokogawa M;Osawa M;Takeuchi K;Mase Y;Shimada I
• 通讯作者: Shimada I

Structural basis underlying the dual gate properties of KcsA

• DOI: 10.1073/pnas.0911270107
• 发表时间: 2010-04-06
• 期刊: PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
• 影响因子: 11.1
• 作者: Imai, Shunsuke;Osawa, Masanori;Shimada, Ichio
• 通讯作者: Shimada, Ichio

高分子量蛋白質の構造解析に適した安定同位体ラベル法および測定法の開発

开发适用于高分子量蛋白质结构分析的稳定同位素标记和测量方法

• 发表时间: 2010
• 作者: 山本俊至;下島圭子;木部哲也;横地健治;竹内恒
• 通讯作者: 竹内恒