ハイブリッドミクロスフェアの作製とその認識・分離機能の利用

杂化微球的制备及其识别分离功能的利用

基本信息

批准号：
63604583
负责人：
川口春馬
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-63604583/
关键词：
転写制御タンパク質 DNA ラテックス粒子タンパク質分離特異吸着

项目摘要

標記研究において、本年度は特に、特定の塩基配列を持ったDNA鎖のラテックス粒子への固定、さらにそれを用いた転写制御タンパク質の分離・精製について研究した。ラテックス粒子は、ソープフリー乳化重合により調整した。種々のラテックス粒子のうち、適度の親水性をもちタンパク質の非特異吸着を受けにくい点、および、DNA固定のための原子団を有する点とから、ポリグリシジルメタクリレート粒子が適当であると判定した。DNAは転写制御タンパク質E4TF1またはE4TF3に認識される塩基配列15b.p.程度からなるものを重合し約300b.p.にしたものを用いた。DNAの固定はBrCN法で行ない、固定のための最適条件を検討した。見い出された最適の濃度、PH、温度では、粒子あたり約100本程度のDNA鎖を有するラテックス粒子が得られた。こうして得られたDNA固定ラテックス粒子を用いて、HeLaの細胞の抽出液からE4TF1、E4TH3の分離・精製を行ったところ、コンペティターpoly(dI-dC)を共存させた系で、電気泳動バンド上にほぼ単一バンドとみなせるほどまでに精製できた。なお精製されたタンパク質が転写制御機能を保持していることも確認した。本法は硬質粒子を用いたバッチ法によるアフィニティ分離であり、カラム法と比べ、格段に迅速に、簡便に、かつ効率よく、それぞれの転写制御タンパク質を精製することができた。今後は、粒子への非特異吸着を防ぐための対策、DNaseによるラテックス粒子上のDNA鎖の切断の防止などについて研究を続ける。また、DNA鎖以外に、レクチンやオリゴ糖固定粒子の作製、その機能についての研究も行う。研究に協力頂いた東大医半田宏博士に感謝致します。

在今年的文章研究中，我们特别研究了具有特定碱基序列的DNA链在乳胶颗粒上的固定化，以及使用它们的转录控制蛋白的分离和纯化。乳胶颗粒是通过无肥皂乳液聚合制备的。在各种乳胶颗粒中，甲基丙烯酸酯颗粒被确定为适合，因为它们具有中等的亲水性，并且很可能受到蛋白质非特异性吸附的可能性，并且因为它们具有用于DNA固定化的原子基团。 DNA由约15b.p的聚合核苷酸序列制成。由转录控制的蛋白E4TF1或E4TF3识别，然后大约300b.p。使用BRCN方法固定DNA，并检查了最佳固定条件。在最佳浓度，发现的pH和温度下，获得了每个粒子约100个DNA链的乳胶颗粒。使用如此呈现的DNA固定乳胶颗粒，将E4TF1和E4TH3分离并从HeLa细胞的提取物中进行纯化，并且可以将poly（di-dc）共存的系统纯化，以至于可以将其视为几乎是电泳带上的单个带。还确认纯化的蛋白质保留了转录控制功能。该方法涉及使用批处理方法使用硬粒子的亲和力分离，与列方法相比，每个转录调节的蛋白质的纯化速度明显更快，更方便，更有效。将来，我们将继续研究措施，以防止颗粒上的非特异性吸附，并防止DNase在乳胶颗粒上裂解DNA链。除了DNA链外，我们还将对凝集素和寡糖固定颗粒的生产和功能进行研究。我们要感谢东京大学医生汉达·希罗希博士在研究方面的合作。