ホモFRETによる複数機能の可視化技術開発

使用homo-FRET开发多种功能的可视化技术

基本信息

批准号：
19021002
负责人：
永井健治
金额：
$ 2.88万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19021002/
关键词：
イメージング FRET 顕微鏡可視化

项目摘要

生体分子の機能を可視化するために波長の異なる2つの蛍光分子間で起こるFRET(ヘテロFRET)を利用した様々なプローブが近年開発されている。これらのFRETプローブは観察するための波長が広域であるため、他の蛍光プローブと同時に可視化することが難しい。そこで同一蛍光色分子間で生じるホモFRETを原理とするカルシウムセンサーW-cameleonを作成し、Ca^<2+>の有無での蛍光異方性を測定することが本研究の柱の1つである。今年度は昨年度作成したW-cameleonに様々な変異を導入することでダイナミックレンジの拡大化を行った。その結果、Ca^<2+>センサードメインであるCalmodulin内に蛍光タンパク質を挿入することで、より大きなダイナミックレンジを有するプローブを得ることに成功した。次に、作成したホモFRETプローブの蛍光異方性変化を顕微鏡下で高感度に観察するために、昨年度までに構築した蛍光偏光顕微鏡に改良を加えた。具体的には一片が5μm程度のフォトニック結晶製波長板と偏光板を組み合わせて、マルチアレー化した偏光解消補償板を開発し、対物レンズの後側焦点面に導入することで、高い消光比を得ることに成功した。これにより、対物レンズによる入射光の偏光解消が緩和され、僅かな蛍光異方性変化をも顕微鏡下で捉えることが可能になった。

近年来，人们开发了各种利用 FRET（异质 FRET）的探针来可视化生物分子的功能，FRET 发生在两个不同波长的荧光分子之间。这些 FRET 探针可以在很宽的波长范围内进行观察，因此很难与其他荧光探针同时观察它们。因此，这项研究的支柱之一是创建钙传感器W-cameleon，它基于相同荧光颜色分子之间发生的同源FRET原理，并测量存在和不存在的荧光各向异性Ca^<2+>。今年，我们通过向去年创建的 W-cameleon 引入各种突变来扩大动态范围。结果，他们通过将荧光蛋白插入到钙调蛋白（Ca 2+ 传感器结构域）中，成功获得了具有更大动态范围的探针。接下来，为了在显微镜下高灵敏度地观察制作的同型FRET探针的荧光各向异性的变化，我们对去年建造的荧光偏振显微镜进行了改进。具体来说，我们开发了一种多阵列消偏补偿器，将长度约为5μm的光子晶体波片和偏光板组合在一起，并将其引入物镜的后焦平面，实现了高消光比。成功获取。这减轻了物镜引起的入射光的去偏振，使得可以在显微镜下捕获荧光各向异性的微小变化。