吸収位相差顕微鏡の開発

吸收相差显微镜的研制

• 批准号: 17657066
• 负责人: 永井 健治
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17657066/
• 关键词: 顕微鏡; 蛍光タンパク質; 可視化; イメージング; 位相差法

本研究では、生体試料の観察の自由度を増すため微弱な吸収分布を高感度に計測する手法を考案し、吸収分布増感対物レンズの開発を目指した。従来より顕微鏡下での光学像観察には吸収・蛍光・位相差等の観察手法が用いられている。吸収(励起)波長または発光(蛍光)波長を選択することにより観察対象を識別できる。選択性を制御するため染色して観察する場合も多い。得られた光学像から吸光度または発光輝度を求めることにより定量計測が可能となる。吸収分布計測に用いる照明光強度は一般的に蛍光分布計測時よりも低く、試料に対する侵襲性を抑えた観測ができる。多くの場合吸収量は微量であり、吸収分布を高感度に計測する手法を実現することは、観測対象・機会の拡大に有意義である。非染色での観測の可能性も出てくる。吸収分布を高感度に計測するには、試料の吸光度を増幅して観測すれば良い。吸光度の増幅には大きく分けて、後処理にて電気的に増幅する手法と、リアルタイムに光学的に増幅する手法が考えられる。本年度は、観測系に工夫を加え光学的に増幅する手法を考案した。本手法を用いれば吸光度が増幅された光学像が得られる。検出に伴う雑音とは無関係に吸光度を増幅した観測ができる。後処理にてさらに増幅することも可能である。光学的に並列処理するため直接増幅像を目視にて観察することも可能である。実際の光学系は、コンデンサーレンズの前側焦点に位相差法と同様のリングスリットを挿入し、観察側は対物レンズの後側焦点面のリングスリットを通過した光の0次回折光が投影する領域にND膜を設置した。観察試料としては蛍光タンパク質を細胞核に発現する培養細胞を用いた。細胞核のみ吸収が増幅されて観測されることが期待されたが、位相情報による像形成が吸収情報を覆い隠してしまい、全く吸収像は観察されなかった。現在、位相情報を排除する光学系を考案中である。

在本研究中，我们设计了一种高灵敏度测量弱吸收分布的方法，以增加观察生物样品的自由度，并旨在开发吸收分布敏感的物镜。传统上，诸如吸收、荧光和相差等观察技术已被用于在显微镜下观察光学图像。通过选择吸收（激发）波长或发射（荧光）波长可以识别观察目标。在许多情况下，对其进行染色和观察以控制选择性。通过从获得的光学图像确定吸光度或亮度，可以进行定量测量。用于吸收分布测量的照明光强度通常低于用于荧光分布测量的照明光强度，从而可以对样品进行较小的侵入性观察。在大多数情况下，吸收量很小，开发一种高灵敏度测量吸收分布的方法对于扩大观测目标和机会具有重要意义。也可以在不染色的情况下进行观察。为了高灵敏度地测量吸光度分布，放大样品的吸光度并观察就足够了。吸光度放大大致可分为两种方法：后处理中的电放大和实时的光学放大。今年，我们修改了观测系统并设计了光学放大方法。使用这种方法，可以获得具有放大吸光度的光学图像。无论与检测相关的噪音如何，都可以利用放大的吸光度进行观察。还可以在后期处理中进一步放大。由于进行光学并行处理，因此还可以直接目视观察放大图像。在实际光学系统中，在聚光透镜的前焦点处插入与相衬法中使用的类似的环形狭缝，并将观察侧置于经过光的0级衍射光的区域。穿过物镜后焦平面的环形狭缝进行投影，并安装了 ND 胶片。使用在细胞核中表达荧光蛋白的培养细胞作为观察样品。原本预计只会观察到细胞核的吸收放大，但基于相位信息的图像形成掩盖了吸收信息，根本没有观察到吸收图像。我们目前正在设计一种消除相位信息的光学系统。

项目成果

今、蛍光タンパク質で何ができるか?

现在我们可以用荧光蛋白做什么？

• 发表时间: 2006
• 期刊: 生化学 78・8
• 作者: Kazuno AA;Munakata K;Nagai T;Shimozono S;Tanaka M;Yoneda M;Kato N;Miyawaki A;Kato T;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治
• 通讯作者: 永井健治

組織・個体レベルでの機能イメージングに向けて

走向组织/个体水平的功能成像

• 发表时间: 2006
• 期刊: 細胞工学 25・9
• 作者: Kazuno AA;Munakata K;Nagai T;Shimozono S;Tanaka M;Yoneda M;Kato N;Miyawaki A;Kato T;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治
• 通讯作者: 永井健治

電顕に期待するもの 4.

4. 电子显微镜的观察结果

• 发表时间: 2006
• 期刊: 細胞工学、25(10)、1192-1193 25・10
• 作者: Kazuno AA;Munakata K;Nagai T;Shimozono S;Tanaka M;Yoneda M;Kato N;Miyawaki A;Kato T;永井健治;永井健治
• 通讯作者: 永井健治

Identification of mitochondrial DNA polymorphisms that alter mitochondrial matrix pH and intracellular calcium dynamics.

• DOI: 10.1371/journal.pgen.0020128
• 发表时间: 2006-08
• 期刊: PLOS GENETICS
• 影响因子: 4.5
• 作者: Kazuno, An-a;Munakata, Kae;Nagai, Takeharu;Shimozono, Satoshi;Tanaka, Masashi;Yoneda, Makoto;Kato, Nobumasa;Miyawaki, Atsushi;Kato, Tadafumi
• 通讯作者: Kato, Tadafumi

円順列GFP変異体を利用した機能プローブの作製法と2波長励起1波長取得共焦点イメージング

使用循环排列 GFP 突变体和双波长激发和单波长采集共焦成像的功能探针的制造方法

• 发表时间: 2006
• 期刊: 実験医学別冊 : 染色・バイオイメージング実験ハンドブック羊土社
• 作者: Kazuno AA;Munakata K;Nagai T;Shimozono S;Tanaka M;Yoneda M;Kato N;Miyawaki A;Kato T;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治;永井健治
• 通讯作者: 永井健治