光操作によるマルチスケール機能イメージング法の開発

利用光学操纵的多尺度功能成像方法的发展

基本信息

批准号：
20034001
负责人：
永井健治
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20034001/
关键词：
生体分子光活性化可視化 FRET 顕微鏡

项目摘要

本研究は、光照射によって、蛍光活性化する生理機能センサータンパク質を開発することで、生きた細胞内や個体内の、ナノからマクロに及ぶ、様々な空間スケールにおける生理機能を高感度に観察する手法を構築することを目的とした。昨年度に作製したPA-GFPとDsRedをFRETのドナー・アクセプターとして利用した光活性化型Ca^<2+>指示薬PA-cameleonは光活性化前の状態でもDsRedによる青色励起光の吸収により蛍光が観察されたため、光活性化の利点の1つである高いコントラストを実現することができなかった。その一方で、405nmのレーザーを照射し、PA-GFPを活性化すると、緑色の蛍光が現れ、リガンド刺激に伴う細胞内Ca^<2+>濃度の変化を捉えることができた。本年度はDsRed以外の赤色蛍光タンパク質や緑色光を吸収するが蛍光性の無い色素タンパク質を用いる事で光活性化によるコントラストのさらなる増加が実現できないかを検討した。その結果、試験管内、細胞内のいずれにおいても405nmの刺激光照射によって不可逆的に無蛍光状態から蛍光性を獲得することが確認され、刺激光の照射範囲をガルバノミラーなどで制御することで、培養ディッシュ上の特定の細胞にPA-cameleonを出現させ、その細胞内のCa^<2+>動態を高いコントラストで可視化することに成功した。さらに、ゼブラフィッシュ幼魚における特定の筋細胞の自発的収縮とCa^<2+>濃度の変化を同時に観察することにも成功した。本方法はCa^<2+>指示薬以外のFRET指示薬にも原理的には応用可能であるため、光活性化指示薬開発のための汎用的指針として、その利用が期待される。

这项研究旨在通过开发由光照射荧光激活的生理功能传感器蛋白，在从纳米到宏观的各种空间尺度上高度灵敏地观察活细胞和个体的生理功能。 PA-cameleon是去年创建的一种光激活Ca ^ 2+ 指示剂，它使用PA-GFP和DsRed作为FRET的供体和受体，甚至在光激活之前就由于DsRed吸收蓝色激发光而表现出荧光。结果，无法实现高对比度，而这是光活化的优点之一。另一方面，当通过用405nm激光照射激活PA-GFP时，出现绿色荧光，使得可以检测由于配体刺激引起的细胞内Ca 2+ 浓度的变化。今年，我们研究了是否可以通过使用 DsRed 以外的红色荧光蛋白或吸收绿光但不发出荧光的色素蛋白，通过光激活进一步提高对比度。结果证实，405 nm刺激光照射在体外和细胞内都会不可逆地将荧光状态改变为荧光状态，并且通过使用检流计镜控制刺激光的照射范围，我们成功地使PA-cameleons出现在培养皿上的特定细胞并以高对比度可视化细胞内Ca^2+动态。此外，我们成功地同时观察了幼年斑马鱼特定肌肉细胞的自发收缩和Ca 2+ 浓度的变化。由于该方法原则上可以应用于除Ca ^ 2+ 指示剂之外的FRET指示剂，因此其有望用作光激活指示剂开发的通用指南。