完全定量1分子共鳴エネルギー移動測定によるタンパク質構造動態解析法の確立

利用完全定量单分子共振能量转移测量建立蛋白质结构动力学分析方法

基本信息

  • 批准号:
    19042001
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 3.84万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
  • 财政年份:
    2007
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2007 至 2008
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

本研究は、1タンパク質レベルにおけるFRETのエネルギー移動効率とドナー・アクセプター分子間の相対角度の測定を同時に行う技術を開発し、タンパク質の立体構造変化を解析する手法を確立することが目的である。今年度は、calmodulinタンパク質のN末端とC末端にCy3、Cy5などの蛍光団を標識したものを作成し、昨年度に構築した1分子デフォーカス顕微鏡の評価を行った。またCa2+指示薬カメレオンYC3.60の2次元結晶をガラス基板上に固定し、Ca2+の有無における蛍光異方性の変化から立体構造変化を解析する手法の確立も行った。また、本研究では1分子蛍光観察が必要であるが、従来の蛍光タンパク質では光安定性が悪く、観察中に素早く褪色してしまい、長時間の観察を行うことが不可能であった。そこで、GFPをタンデムに連結することで、蛍光強度を上げる戦略ならびに、光安定性が極めて高い新規蛍光タンパク質の開発も同時に行った。その結果、報告されている蛍光タンパク質の中で最も短波長の蛍光 (424nm) を発する群青色蛍光タンパク質Siriusを開発することに成功した。SiriusはEBFP比で約60倍の光安定性を有するのみならず、その蛍光強度がpH耐性であるという特徴を有していた。さらに、Siriusの蛍光スペクトルがCFPの吸収スペクトルと大きく重なることから、SiriusからCFPへの高効率なFRETが起こる可能性が考えられた。そこで、SiriusとCFPの融合タンパク質を作成したところ、予想通り比較的効率良くFRETが起こることを確認することができた。
这项研究旨在开发一种技术,该技术同时测量单个蛋白水平和供体和受体分子之间的相对角度的FRET的能量传递效率,并建立一种分析蛋白质构象变化的方法。今年,我们创建了诸如CY3和CY5之类的荧光团,这些荧光团在钙调蛋白蛋白的N-和C末端标记,并评估了去年构建的单分子降解显微镜。此外,还建立了一种方法来固定玻璃基板上Ca2+指标变色龙YC3.60的二维晶体,​​并在存在或不存在Ca2+的情况下分析荧光各向异性变化的构象变化的变化。此外,尽管本研究需要单分子荧光观察,但常规的荧光蛋白的光稳定性较差,并且在观察过程中迅速褪色,因此无法进行长期观察。因此,我们还制定了一种通过将GFP连接到串联以及具有极高光稳定性的新型荧光蛋白来增加荧光强度的策略。结果,我们成功地开发了Sirius,Sirius是一种蓝色荧光蛋白,在报道的荧光蛋白中排放了最短的荧光波长(424nm)。 Sirius不仅具有EBFP比的光稳定性的60倍,而且具有抗荧光强度的pH值的特征。此外,由于Sirius的荧光光谱与CFP的吸收光谱重叠,因此可以认为可能会发生从Sirius到CFP的高效FRET。因此,当我们在Sirius和CFP之间创建融合蛋白时,我们能够确认FRET是按照预期的相对有效的。

项目成果

期刊论文数量(49)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
大口径ファイバー白色光源を用いた高速共焦点顕微鏡の開発と評価
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    齊藤健太;谷知己;小林健太郎;永井健治
  • 通讯作者:
    永井健治
新規の光変換蛍光蛋白質プローブを用いた生体イメージングと動態解析
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    松田知己;永井健治
  • 通讯作者:
    永井健治
Engineering fluorescent proteins to visualize and manipulate biological functions
工程荧光蛋白以可视化和操纵生物功能
  • DOI:
  • 发表时间:
    2008
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Tomisaka;Y. ; Nomoto;A. ; Ogawa A.;Fumi Nagatsugi;Takeharu Nagai;小松紘一(代表);永次史;Takeharu Nagai
  • 通讯作者:
    Takeharu Nagai
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    川口真一;小川昭弥;他3名;桑原俊介;永井健治
  • 通讯作者:
    永井健治
群青色蛍光タンパク質
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2007
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
  • 通讯作者:
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知道了