完全定量1分子共鳴エネルギー移動測定によるタンパク質構造動態解析法の確立

利用完全定量单分子共振能量转移测量建立蛋白质结构动力学分析方法

基本信息

批准号：
19042001
负责人：
永井健治
金额：
$ 3.84万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19042001/
关键词：
FRET 1分子顕微鏡可視化

项目摘要

本研究は、1タンパク質レベルにおけるFRETのエネルギー移動効率とドナー・アクセプター分子間の相対角度の測定を同時に行う技術を開発し、タンパク質の立体構造変化を解析する手法を確立することが目的である。今年度は、calmodulinタンパク質のN末端とC末端にCy3、Cy5などの蛍光団を標識したものを作成し、昨年度に構築した1分子デフォーカス顕微鏡の評価を行った。またCa2+指示薬カメレオンYC3.60の2次元結晶をガラス基板上に固定し、Ca2+の有無における蛍光異方性の変化から立体構造変化を解析する手法の確立も行った。また、本研究では1分子蛍光観察が必要であるが、従来の蛍光タンパク質では光安定性が悪く、観察中に素早く褪色してしまい、長時間の観察を行うことが不可能であった。そこで、GFPをタンデムに連結することで、蛍光強度を上げる戦略ならびに、光安定性が極めて高い新規蛍光タンパク質の開発も同時に行った。その結果、報告されている蛍光タンパク質の中で最も短波長の蛍光 (424nm) を発する群青色蛍光タンパク質Siriusを開発することに成功した。SiriusはEBFP比で約60倍の光安定性を有するのみならず、その蛍光強度がpH耐性であるという特徴を有していた。さらに、Siriusの蛍光スペクトルがCFPの吸収スペクトルと大きく重なることから、SiriusからCFPへの高効率なFRETが起こる可能性が考えられた。そこで、SiriusとCFPの融合タンパク質を作成したところ、予想通り比較的効率良くFRETが起こることを確認することができた。

本研究的目的是开发一种在单一蛋白质水平上同时测量FRET能量转移效率和供体与受体分子相对角度的技术，并建立分析蛋白质构象变化的方法。今年，我们创建了一种在N端和C端标记有Cy3和Cy5等荧光团的钙调蛋白，并对我们去年构建的单分子离焦显微镜进行了评估。我们还将Ca2+指示剂Chameleon YC3.60的二维晶体固定在玻璃基板上，并建立了一种分析Ca2+存在或不存在下荧光各向异性变化引起的构象变化的方法。此外，该研究需要单分子荧光观察，但常规荧光蛋白的光稳定性较差，观察过程中很快褪色，无法进行长期观察。因此，我们同时开发了一种通过串联GFP来增加荧光强度的策略，以及一种具有极高光稳定性的新型荧光蛋白。结果，他们成功开发了一种群青荧光蛋白Sirius，它是已报道的荧光蛋白中发射波长最短的荧光（424 nm）。 Sirius不仅具有比EBFP高约60倍的光稳定性，而且还具有荧光强度耐pH的特性。此外，由于Sirius的荧光光谱与CFP的吸收光谱很大程度上重叠，因此认为可能会发生从Sirius到CFP的高效FRET。因此，当我们在 Sirius 和 CFP 之间创建融合蛋白时，我们能够确认 FRET 相对有效地发生，正如预期的那样。