原子分解能かつナノ秒時間分解能でのプリオン・フォールディング反応の観測

以原子分辨率和纳秒时间分辨率观察朊病毒折叠反应

• 批准号: 18031015
• 负责人: 桑田 一夫
• 金额: $ 7.23万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18031015/
• 关键词: プリオン; フォールディング; 温度ジャンプ; ナノ秒分光; 赤外吸収; 部分ペプチド; アミロイド; オリゴマー; βシート; 細菌毒性; 構造変換; 疎水性クラスター

蛋白質構造形成の初期過程の観測において,これまで一般的に用いられて来た高速混合法の不感時間は100マイクロ秒からミリ秒のオーダーであり,蛋白質の構造形成過程を観測するには不十分な場合が多かった。マウスプリオンのフォールディング反応においては,ヘリックスB,Cの形成反応は約50μsの時定数であるが,ヘリックスAの形成反応はさらに速く,時定数を求める試みには成功していない。我々は,本研究プロジェクトにおいて,蛋白質の速いフォールディング反応を追跡するため,ナノ秒分解能(不感時間:300ナノ秒)をもつレーザー温度ジャンプシステムを開発した。本システムでは,YAGレーザーにより発振された波長1064nmのパルスレーザー光が,水素ガスを封入されたラマンシフターを通り1907nmに変換される。このレーザー光はサンプル水溶液に吸収され,サンプルの温度を10ナノ秒で15~30℃上昇させる。本プロジェクトでは,蛍光,及び赤外吸収で観測するシステムを構築した。赤外ランプから出た赤外光を,バンドパスフィルターで選択して(1600cm^<-1>,1664cm^<-1>)プローブ光とし,ナノ秒の時間分解が可能なMCT検出器で観測した。このシステムにより温度ジャンプに伴う蛋白質の二次構造応答をナノ秒時間分解でモニターすることが可能となった。我々は,全長プリオンタンパク質(F175W)を作成し,それが低温で不安定化する現象を解析した。さらに,本システムを用い,この状態からの全長プリオンタンパク質(20μM)の温度ジャンプ・レスポンスを観測し,1600cm^<-1>において,約20μs程度の時定数をもつ新たな相を発見した。この相はいままで観測されたことのない特徴的な挙動を示しており,プリオンの立体構造形成に関する新たな知見である,と考えられる(論文作成中)。以上の研究によ,り,1分子ナノ秒時間分解フォトンカウンティング観測装置,及びNMRによる原子分解能温度ジャンプ観測装置の開発にも見通しが立った。

目前常用的观察蛋白质结构形成初始过程的高速混合方法的死区时间在100微秒至毫秒量级，不足以观察蛋白质结构形成的过程。 。在小鼠朊病毒折叠反应中，螺旋B和C形成的时间常数约为50μs，但螺旋A的形成反应更快，确定时间常数的尝试尚未成功。在这个研究项目中，我们开发了具有纳秒分辨率（死区时间：300纳秒）的激光温度跳跃系统来跟踪蛋白质的快速折叠反应。在该系统中，YAG激光器发射的波长为1064 nm的脉冲激光通过充满氢气的拉曼移位器转换为1907 nm。该激光被样品水溶液吸收，在10纳秒内使样品温度升高15~30℃。在这个项目中，我们构建了一个观察荧光和红外吸收的系统。从红外灯发出的红外光被带通滤光片(1600cm^-1>、1664cm^<-1>)选择并用作探测光，用具有纳秒时间分辨率的MCT探测器进行观察。该系统使得以纳秒时间分辨率监测由于温度跃变而引起的蛋白质二级结构响应成为可能。我们创建了全长朊病毒蛋白 (F175W) 并分析了其在低温下的不稳定情况。此外，使用该系统，我们观察了全长朊病毒蛋白（20μM）从该状态的温度跳跃响应，并发现了在1600cm^<-1>处时间常数约为20μs的新相。该相表现出以前从未观察到的特征行为，被认为是关于朊病毒三维结构形成的新发现（论文正在进行中）。上述研究为单分子纳秒级时间分辨光子计数观测装置和利用核磁共振的原子分辨率温度跳跃观测装置的发展提供了前景。

项目成果

Modeling of a propagation mechanism of infectious prion protein; a hexamer as the minimum infectious unit

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2007.07.103
• 发表时间: 2007-09-28
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Nakamura, Hironorl K.;Takano, Mitsunori;Kuwata, Kazuo
• 通讯作者: Kuwata, Kazuo

プリオンのダイナミクスに基づく抗プリオン薬のデザイン

基于朊病毒动力学的抗朊病毒药物设计

• 发表时间: 2007
• 作者: 桑田一夫;鎌足雄司;松本友治;中村寛則;早野陽介
• 通讯作者: 早野陽介

アミロイドーシス発症の分子機構解明を目指して : 現状と展望、夢

旨在阐明淀粉样变性发病的分子机制：现状、前景和梦想

• 发表时间: 2007
• 期刊: 細胞工学 26
• 作者: 後藤祐児;桑田一夫;関島良樹;田中元雅;内木宏延;永井義隆;松崎勝巳;樋口京一
• 通讯作者: 樋口京一

Species specific differences in the intermediate states of human and hamster prion protein detected by high pressure NMR spectroscopy.

通过高压核磁共振波谱检测人类和仓鼠朊病毒蛋白中间态的物种特异性差异。

• 发表时间: 2007
• 期刊: J.Biol.Chem. 282
• 作者: Werner Kremer;Norman Kachel;Kazuo Kuwata;Kazuyuki Akasaka;Hans Robert Kalbitzer
• 通讯作者: Hans Robert Kalbitzer

Effect of Hunter disease (mucopoly saccharidosis type II) mutations on molecular phenotypes of iduronate-2-sulfatase

亨特病（II 型粘多糖贮积症）突变对艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶分子表型的影响

• 发表时间: 2006
• 期刊: J Inherit Metab Dis 29
• 作者: K.Sukegawa-Hayasaka;Z.Kato;H.Nakamura;S.Tomatsu;T.Fukao;K.Kuwata;T.Orii;N.Kondo
• 通讯作者: N.Kondo