IL-2/Il-2R複合体形成機構の構造生物学的基盤

IL-2/IL-2R复合物形成机制的结构生物学基础

基本信息

批准号：
17053022
负责人：
池水信二
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17053022/
关键词：
蛋白質免疫学生体分子生物物理シグナル伝達

项目摘要

細菌やウイルスなどの外部由来物質から、我々ヒトは免疫により守られている。外部由来物質を認識したT細胞は、インターロイキン(IL)-2およびIL-2受容体(R)を産生する。IL-2Rはα,β,γ鎖と呼ばれる3種類のサブユニットから構成されており、IL-2を介してヘテロ3量体を形成することにより、T細胞内に増殖シグナルを誘導する。この結果、抗原に特異的に応答するT細胞が増殖し、免疫応答を活性化する。IL-2は1980年代後半に結晶構造が解析されたが、IL-2Rの3つのサブユニットの構造は何れも未知であり、認識機構に関する構造生物学的知見は得られていなかった。そこで、3種類のIL-2Rの単独、およびIL-2/IL-2R複合体の結晶構造を明らかにし、IL-2とIL-2Rの認識機構を構造生物学的に解明することを思い立った。IL-2Rα細胞外ドメインのC末端にHis-tagを付加する様に遺伝子の改変を行い、大腸菌を用いた発現系を構築した.その後,Niカラム・ゲルろ過・イオン交換クロマトグラフィーにより精製を行った.IL-2RβおよびIL-2Rγの細胞外ドメインにはN型糖修飾部位が各々4ヶ所および6ヶ所あるため,CHO変異体細胞であるLec3.8.2.1(LecR)細胞を用いて発現することを計画した.LecR細胞が産生する蛋白質は,endoHを用いてNアセチルグルコサミンを1残基残して切除することが可能であり,結晶解析に適している.そこで,IL-2RβおよびIL-2Rγの細胞外ドメインの安定発現株をLecR細胞を用いて構築を行った.IL-2Rβについては,高発現株の選択・精製・結晶化を行い,微結晶を得た.IL-2Rγについては,高発現株の選択を終え,大量培養・精製法を確立した.

我们人类通过免疫力免受细菌和病毒等外部物质的侵害。识别外来物质的 T 细胞产生白细胞介素 (IL)-2 和 IL-2 受体 (R)。 IL-2R 由 α、β 和 γ 链三种亚基组成，通过 IL-2 形成异源三聚体，诱导 T 细胞内的增殖信号。结果，对抗原特异性反应的 T 细胞增殖并激活免疫反应。虽然IL-2的晶体结构在20世纪80年代末被分析，但IL-2R的所有三个亚基的结构仍是未知的，并且没有获得关于识别机制的结构生物学知识。因此，我们决定阐明三种类型的IL-2R单独和IL-2/IL-2R复合物的晶体结构，并从结构生物学角度阐明IL-2和IL-2R的识别机制。对该基因进行修饰，在IL-2Rα胞外结构域的C末端添加His标签，并构建使用大肠杆菌的表达系统之后，使用Ni柱、凝胶过滤和离子进行纯化。交换色谱法。由于IL-2Rβ和IL-2Rγ的胞外结构域分别有四个和六个N型糖修饰位点，因此它们使用Lec3.8.2.1（LecR）细胞表达，这是我计划的CHO突变细胞。 LecR 细胞产生的蛋白质可以使用 endH 切除，仅留下一个 N-乙酰氨基葡萄糖残基，使其适合晶体分析。使用LecR细胞构建恒定表达菌株。对于IL-2Rβ，选择高表达菌株，纯化并结晶以获得微晶。对于IL-2Rγ，选择高表达菌株之后，我们建立了大规模培养。和纯化方法。