補助刺激分子のシグナル伝達機構の構造生物学的研究

共刺激分子信号转导机制的结构生物学研究

基本信息

批准号：
14704063
负责人：
池水信二
金额：
$ 15.14万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

ナイーブT細胞の成熟には、主要組織適合抗原(MHC)/T細胞受容体(TCR)複合体を介した抗原特異的なシグナルとB7/CD28複合体を介した補助刺激と呼ばれる抗原非特異的なシグナルの両方が必要である。我々は、前者のシグナル関わる分子として、MHCクラス2(Nature Immunology,2002),LEA-3(Proc.:Natl.Acad.Sci.USA,1999)の構造解析を行った。また後者の補助刺激の構造を基にした知見を得るため、B7-1細胞外ドメインの構造(Immunity,2000)、及びB7-1/CTLA-4複合体の結晶構造(Nature,2001)を明らかにした。TCR及びCD28を介する両シグナルの存在下では、IL-2とIL-2受容体(R)の発現が誘導されT細胞が増殖する。補助のシグナル伝達機構、及びIL-2とIL-2Rの認識機構の構造を基にした解明を計画した。CD28を介するシグナル伝達に関わるGadsの結晶構造解析を目的とした発現系の構築を行った。His-tag修飾したGadsをNiカラムで精製後、mono-Qを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。精製したGadsを用いて結晶化条件の検索を行い、針状の微結晶を得た。現在、結晶化条件の最適化を行っている。IL-2Rは、α,β,γの3種のサブユニットから構成されている。この中で、βとγ鎖がシグナル伝達に関わっているが、重度に糖修飾を受けているいることから、結晶構造解析に適した蛋白質を得難い。そこでendO_H感受性の蛋白質を産生するLec3.2.8.1細胞を用いて安定発現株の構築を行った。IL-2Rβに関しては高発現株のセレクションを終え、現在大量培養を行っている。IL-2Rγに関しては高発現株のセレクションを、現在行っているところである。

初始 T 细胞成熟涉及通过主要组织相容性抗原 (MHC)/T 细胞受体 (TCR) 复合物发出的抗原特异性信号和通过 B7/CD28 复合物发出的称为共刺激的抗原非特异性信号。我们对 MHC 2 类（自然免疫学，2002）和 LEA-3（Proc.：Natl.Acad.Sci.USA，1999）作为参与前一信号的分子进行了结构分析。为了获得基于后者共刺激结构的知识，我们揭示了B7-1胞外结构域的结构（Immunity，2000）和B7-1/CTLA-4复合物的晶体结构（Nature，2001）。我做到了。在 TCR 和 CD28 介导的信号同时存在的情况下，IL-2 和 IL-2 受体 (R) 的表达被诱导，T 细胞增殖。我们计划根据该结构阐明IL-2和IL-2R的辅助信号转导机制和识别机制。我们构建了一个表达系统，用于分析参与 CD28 介导的信号转导的 Gad 的晶体结构。使用 Ni 柱纯化 His 标签修饰的 Gad，然后使用 mono-Q 通过离子交换色谱法纯化。我们使用纯化的 Gads 寻找结晶条件并获得了针状微晶。我们目前正在优化结晶条件。 IL-2R由三个亚基组成：α、β和γ。其中，β链和γ链参与信号转导，但由于它们被大量糖修饰，因此很难获得适合晶体结构分析的蛋白质。因此，我们使用 Lec3.2.8.1 细胞构建了产生 endO_H 敏感蛋白的稳定表达菌株。关于IL-2Rβ，我们已经完成了高表达菌株的筛选，目前正在大量培养。关于IL-2Rγ，我们目前正在筛选高表达的菌株。