DnaK分子シヤペロンによるDNA複製開始タンパク質の活性化過程の解明

DnaK 分子 shaperone 阐明 DNA 复制起始蛋白的激活过程

基本信息

批准号：
17028029
负责人：
三木邦夫
金额：
$ 3.2万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

DnaK分子シャペロン(DnaK, DnaJ, GrpE)が細胞内で合成途中のポリペプチドやタンパク質のfoldingや分解,サブユニットの会合,膜透過などに働くことは良く知られている,これら分子シャペロンにはDNA複製開始因子や転写因子の活性化・不活性化を助ける機能もあるが,その機能タンパク質の調節因子としての作用機構の詳細は解明されていない.大腸菌ミニFの系はこの研究のモデル系として優れている.我々はこれまでに,各分子シャペロンが,RepEの活性化に必須であること,RepEの単量体はイニシエーターとして,二量体はrepE遺伝子のリプレッサーとして機能すること,in vitroでRepE二量体から単量体への変換はDnaK分子シャペロンに担われていることなどを明らかにした.本研究の目的はこの変換機構を分子レベルで明らかにすることで,今年度は次のような成果が得られた.凝集しやすく結晶化が困難である全長RepE二量体について,昨年,オペレータとの複合体の結晶を得たが,タンパク質調製法と結晶化法を工夫することによって,X線回折実験が可能な結晶の調製に成功した.構造解析は,単量体RepE-iteron複合体の構造をモデル分子とする分子置換法で初期位相を決定し,結晶構造の精密化を完了した.その結果,二量体RepE-operator複合体においてもC末ドメインによって共通8塩基対が認識されている一方,N末ドメインはDNAと全く接触せずに,二量体境界面を形成していることが明らかになった.また,二量体と単量体の結晶構造の比較から,両ドメイン内部には構造変化が確認されないものの,ドメイン間の相対配置が大きく異なっていることもわかった.ドメイン間をつなぐリンカー領域ならびにその周辺領域に,DnaKおよびDnaJが相互作用すると予想される配列があった.二量体から単量体への変換による複製開始機能の発現,分子シャペロンの作用機構について議論した.

众所周知，DNAK分子伴侣（DNAK，DNAJ，GRPE）作用于细胞合成过程中多肽和蛋白质的折叠和降解，相关亚基和膜透气化。这些分子伴侣还具有帮助灭活和失活的DNA复制起始因子和转录因子的功能，但是尚未阐明其作用机理作为功能蛋白调节剂的细节。大肠杆菌微型系统是本研究的出色模型系统。我们先前已经表明，每个分子伴侣对于repe的激活，Repe的单体作为启动器和二聚体作为Repe Gene的抑制剂至关重要，这项研究的目的是阐明在体外的Repe Repe二聚体向单体转化为单体，而DNAK分子层状则是责任。这项研究的目的是阐明分子水平的转化机制，今年获得了以下结果。去年，对于易于聚集且难以结晶的全长二聚体，我们从与操作员的复合物中获得了晶体，但是通过设计蛋白质制备和结晶方法，我们成功制备了可用于X射线衍射实验的晶体。结构分析是通过使用分子替换方法使用单体复制复合物作为模型分子的结构来确定初始阶段进行的结构分析，并完成了晶体结构的完善。结果，二聚体用于确定初始阶段。在复制操作员络合物中，C末端结构域识别了八个公共碱基对，而N末端结构域则形成二聚体边界表面而无需完全接触DNA。此外，对二聚体和单体的晶体结构的比较表明，尽管在两个域内没有确认结构变化，但域之间的相对排列差异很大。有望在连接域和周围区域的接头区域中与DNAK和DNAJ相互作用。我们通过从二聚体转换为单体以及分子伴侣的作用机理讨论了复制起始函数的表达。