嗅索道標細胞GFP可視化マウスの作成

具有嗅带标记细胞 GFP 可视化的小鼠的创建

• 批准号: 17023044
• 负责人: 平田 たつみ
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17023044/
• 关键词: 道標細胞; 軸索ガイド; 神経発生; 代謝型グルタミン酸受容体; マウス

嗅球軸索の伸長経路には、モノクローナル抗体lot1で染色される神経細胞群が局在する。これらの細胞を薬剤で破壊すると嗅球軸索の伸長が停止することから、これらが嗅球軸索のガイドを担う道標細胞であると考えられている。しかしその作用は単純な軸索誘引や反発では説明が難しく、道標細胞と軸索との相互作用の詳細な解析が待たれていた。その解析の大きな障害となっていたのが、道標細胞を生きたまま可視化する技術がないことであった。もしこれができれば、実際の嗅球軸索と道標細胞の相互作用をリアルタイムで検出したり、道標細胞の発現遺伝子の網羅的な解析が可能になるなど、大きなブレークスルーとなると期待された。最近の研究で、この道標細胞の特異的マーカーであるモノクローナル抗体lot1が、代謝型グルタミン酸レセプター1(mGluR1)を抗原として認識していることがわかった。mGluR1は成体においては比較的広範囲に発現しているが、発生期終脳においては嗅索道標細胞に非常に限局して発現している。そこで本研究では、mGluR1遺伝子座にEGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)を挿入したノックインマウスを作成し、生体内の嗅索道標細胞の生きたままでの可視化を目指した。定法に従い、mGluR1遺伝子にEGFP cDNAを結合したノックインベクターを作成して、相同組み替えを起こした6個のES細胞クローンを得た。そのうちの3個のクローンを用いてキメラマウスを作成し、ノックイン遺伝子アレルが子孫に伝搬したヘテロマウス3系統を作出した。しかしいずれのマウス系統においても、EGFPの発現は確認できず、さらにノックインアレルをホモに持たせたマウスにおいてもEGFPの発現は確認できなかった。これらのノックインマウスにおいては、mGluR1遺伝子は期待どおり破壊されており、ホモマウスにおいては小脳失調などの顕著な表現系も認められるので、ノックイン操作自体はうまく起こっていると思われる。mGluR1プロモーターの活性が弱くEGFPの発現量が低すぎて検出できない可能性があるのではないかと考えている。

嗅球轴突的延伸途径是由用单克隆抗体lot1染色的一组神经元定位的。这些细胞用药物破坏会导致嗅球轴突的伸长，并认为这些是引导的细胞，它们是嗅球轴突的指南。但是，它的效果很难用简单的轴突吸引力或排斥力来解释，并且正在等待目标细胞与轴突之间的相互作用的详细分析。该分析的主要障碍是缺乏可视化目标细胞的技术。如果可能的话，这将是一个重大突破，因为它可以实时检测嗅球轴突和靶细胞之间的相互作用，以及对靶细胞表达基因的全面分析。最近的研究表明，单克隆抗体Lot1是该靶细胞的特定标记，它识别代谢谷氨酸受体1（MGLUR1）是抗原。 MGLUR1在成年人中相对广泛地表达，但在新生的端脑中，它在嗅觉脊髓状细胞中非常局部表达。因此，在这项研究中，我们用插入MGLUR1基因座的EGFP（增强的绿色荧光蛋白）创建了敲入小鼠，旨在可视化体内嗅觉索索信号细胞。遵循常规方法，创建了与MGLUR1基因结合的敲门载体，以获得六个经历同源重组的ES细胞克隆。这些克隆中的三个用于创建嵌合小鼠，并创建了三个异源菌株，其中敲入基因等位基因传播到后代。但是，在任何一种小鼠菌株中均未证实EGFP的表达，并且在具有敲门等位基因同质的小鼠中均未证实EGFP的表达。在这些敲击小鼠中，MGLUR1基因如预期的那样被破坏，在HOMO小鼠中，还观察到了明显的表达系统，例如小脑共济失调，因此敲入操纵本身似乎是成功的。我们认为，MGLUR1启动子的活性很弱，EGFP的表达水平太低，因此可能无法检测到。