嗅索道標細胞GFP可視化マウスの作成

具有嗅带标记细胞 GFP 可视化的小鼠的创建

• 批准号: 17023044
• 负责人: 平田 たつみ
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17023044/
• 关键词: 道標細胞; 軸索ガイド; 神経発生; 代謝型グルタミン酸受容体; マウス

嗅球軸索の伸長経路には、モノクローナル抗体lot1で染色される神経細胞群が局在する。これらの細胞を薬剤で破壊すると嗅球軸索の伸長が停止することから、これらが嗅球軸索のガイドを担う道標細胞であると考えられている。しかしその作用は単純な軸索誘引や反発では説明が難しく、道標細胞と軸索との相互作用の詳細な解析が待たれていた。その解析の大きな障害となっていたのが、道標細胞を生きたまま可視化する技術がないことであった。もしこれができれば、実際の嗅球軸索と道標細胞の相互作用をリアルタイムで検出したり、道標細胞の発現遺伝子の網羅的な解析が可能になるなど、大きなブレークスルーとなると期待された。最近の研究で、この道標細胞の特異的マーカーであるモノクローナル抗体lot1が、代謝型グルタミン酸レセプター1(mGluR1)を抗原として認識していることがわかった。mGluR1は成体においては比較的広範囲に発現しているが、発生期終脳においては嗅索道標細胞に非常に限局して発現している。そこで本研究では、mGluR1遺伝子座にEGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)を挿入したノックインマウスを作成し、生体内の嗅索道標細胞の生きたままでの可視化を目指した。定法に従い、mGluR1遺伝子にEGFP cDNAを結合したノックインベクターを作成して、相同組み替えを起こした6個のES細胞クローンを得た。そのうちの3個のクローンを用いてキメラマウスを作成し、ノックイン遺伝子アレルが子孫に伝搬したヘテロマウス3系統を作出した。しかしいずれのマウス系統においても、EGFPの発現は確認できず、さらにノックインアレルをホモに持たせたマウスにおいてもEGFPの発現は確認できなかった。これらのノックインマウスにおいては、mGluR1遺伝子は期待どおり破壊されており、ホモマウスにおいては小脳失調などの顕著な表現系も認められるので、ノックイン操作自体はうまく起こっていると思われる。mGluR1プロモーターの活性が弱くEGFPの発現量が低すぎて検出できない可能性があるのではないかと考えている。

一组用单克隆抗体lot1染色的神经元位于嗅球轴突的伸长路径上。当这些细胞被药物破坏时，嗅球轴突的伸长就会停止，因此这些细胞被认为是引导嗅球轴突的路标细胞。然而，这种效应很难用简单的轴突吸引或排斥来解释，人们正在等待对路标细胞和轴突之间相互作用的详细分析。这项分析的一个主要障碍是缺乏在路标细胞还活着时可视化它们的技术。如果这一点能够实现，预计将是一项重大突破，例如能够实时检测嗅球轴突与路标细胞之间的实际相互作用，以及对路标细胞中表达的基因进行综合分析。最近的研究表明，单克隆抗体lot1（这些标志性细胞的特异性标记）可将代谢型谷氨酸受体1 (mGluR1) 识别为抗原。 mGluR1 在成人中表达范围相对较广，但在发育中的端脑中，其表达非常集中于嗅觉尾部细胞。因此，在本研究中，我们创建了将 EGFP（增强型绿色荧光蛋白）插入 mGluR1 基因位点的敲入小鼠，旨在体内可视化嗅觉路标细胞。按照标准方法将EGFP cDNA与mGluR1基因连接，制作敲入载体，获得6个经过同源重组的ES细胞克隆。其中三个克隆被用来创建嵌合小鼠，并创建了三个杂合小鼠品系，其中敲入基因等位基因被传递给它们的后代。然而，在任何小鼠品系中都无法证实EGFP表达，此外，在敲入等位基因纯合的小鼠中也无法证实EGFP表达。在这些敲入小鼠中，mGluR1基因如预期被破坏，纯合子小鼠还表现出小脑共济失调等显着表型，因此看起来敲入操作本身已经成功发生。我们怀疑mGluR1启动子活性较弱，EGFP表达水平太低而无法检测到。