嗅索形成への関与が期待される31C12抗原の発現解析および構造決定

有望参与嗅道形成的31C12抗原的表达分析和结构测定

• 批准号: 09780678
• 负责人: 平田 たつみ
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780678/
• 关键词: 神経; 軸索伸長; モノクローナル抗体; 僧帽細胞; ガイダンス; マウス; lot1抗原

発生時に、嗅球の僧帽細胞の軸索は終脳の外側表面を選択的に伸長し、嗅索を形成する。我々は、僧帽細胞の軸索伸長経路である予定嗅索領域に結合するモノクローナル抗体のスクリーニングを行い、嗅索周辺を特異的に認識するモノクローナル抗体MAblotl(31C2を改名)を得た。この抗体の認識する抗原分子(lotl抗原)は、僧帽細胞軸索伸長の時空間的なパターンに非常に良く一致して発現する。このような発現パターンをもつ分子はこれまでに知られておらず、本研究ではこのlot抗原分子の単離精製を目指した。当初計画していたように、様々な方法により可溶化した蛋白質から、MAblotlにより抗原分子の免疫沈降を試みたが、成功しなかった。失敗の原因はおそらく蛋白質を界面活性剤で可溶化する過程で抗原決定部位が変性してしまったためだと思われる。この結果から免疫沈降により抗原分子を精製することは不可能であると結論し、発現クローニングによるlot抗原分子の同定に戦略を変更した。MAblotlの抗原決定部位は非常に変性しやすいため、発現クローニングを行うためにはなるべくnativeに近い構造のlot抗原を発現させる必要がある。そこで、培養動物細胞(COS細胞)にcDNA発現ライブラリーを導入して強制発現させ、その中からMAblotlで染色される細胞を生じるクローンをスクリーニングする事にした。現在lot抗原が最も強く発現しているマウス14.5日胚の副嗅球からmRNAを調製して、cDNA発現ライブラリーを作成中である。

在发育过程中，嗅球中二尖瓣细胞的轴突选择性地延伸穿过端脑的侧面以形成嗅道。我们筛选了与预期嗅道区域（即二尖瓣细胞的轴突伸长通路）结合的单克隆抗体，获得了特异性识别嗅道周围区域的单克隆抗体MAblotl（更名为31C2）。该抗体识别的抗原分子（lotl抗原）的表达与二尖瓣细胞轴突生长的时空模式非常一致。迄今为止，尚不知道具有这种表达模式的分子，在本研究中，我们旨在分离和纯化该批次抗原分子。按照最初计划，我们尝试使用 MAblotl 从使用各种方法溶解的蛋白质中免疫沉淀抗原分子，但没有成功。失败的原因可能是在用表面活性剂溶解蛋白质的过程中，抗原决定位点发生了变性​​。从这个结果，我们得出结论，通过免疫沉淀纯化抗原分子是不可能的，并将我们的策略改为通过表达克隆鉴定大量抗原分子。 MAblotl的抗原决定位点极易发生变性，因此为了进行表达克隆，需要表达大量结构尽可能接近天然的抗原。因此，我们决定将cDNA表达文库引入培养的动物细胞（COS细胞）中，强制表达，并筛选产生可以用MAblotl染色的细胞的克隆。我们目前正在通过从 14.5 天小鼠胚胎的副嗅球（批次抗原表达最强）中制备 mRNA 来创建 cDNA 表达文库。

项目成果

T.Kitsukawa et al.: "Neuropilin-Semaphorin III/d-mediated Chemorepulsive Signals play a Crucial role in prripheral nerve Projection in mice" Neuron. 19. 995-1005 (1997)

T.Kitsukawa 等人：“Neuropilin-Semaphorin III/d 介导的化学脉冲信号在小鼠周围神经投射中发挥着至关重要的作用”Neuron。

平田たつみ 佐藤泰史: "マウス終脳培養を用いた軸索ガイダンス機構の解析" 細胞工学. 18. 77-83 (1999)

Tatsumi Hirata 和 Yasushi Sato：“利用小鼠端脑培养物分析轴突引导机制”《细胞工程》18. 77-83 (1999)。