小麦胚芽抽出物中に含まれるプロリン脱水素酵素の選択的阻害剤の開発

小麦胚芽提取物中脯氨酸脱氢酶选择性抑制剂的研制

基本信息

批准号：
16048222
负责人：
森田勇人
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ハイスループットなタンパク質の構造機能相関の解明を行うにあたり、均質なタンパク質の大量調整法の確立は必要不可欠である。これまでに我々は、小麦胚芽抽出物を用いた無細胞タンパク質合成系を利用することで、生理活性を保持したタンパク質大量発現系を確立するとともに、アミノ酸選択的安定同位体標識技術を、プロリン以外の19種類のアミノ酸に対して確立した。一方、多くの植物では、プロリンとグルタミン酸との間で相互変換を行う系が存在することが知られている。これらの系の存在から我々は、^1H-^<15>N HSQCスペクトルの帰属に基づくタンパク質主鎖の構造情報解析には殆ど影響しないが、^<13>C標識を行うことによる側鎖の構造情報解析においては無視できない影響を与えると予測し、相互変換の系を効率的にブロックする手法開発を行った。プロリンからグルタミン酸への変換において作用するプロリン脱水素酵素活性を阻害するために、親水性置換基による溶解度向上が図られたヒドロキシキノリン誘導体を用い、タンパク質合成能を阻害しない濃度域における阻害能を評価した。一方、グルタミン酸のプロリンへの変換において作用する2種の酵素のうちP5CRはMg^<2+>等の2価イオン濃度が高いと活性阻害を受けるが、高いマグネシウムイオン濃度下ではタンパク質合成が阻害されるため、もう1つの酵素であるP5CSのオルニチンによる阻害(0.37mM at 50% inhibition)の有効性を評価した。いずれの経路についても、^<13>C,^<15>N二重標識プロリンならびにプロリン以外の^<15>N単独標識アミノ酸によるHNCOスペクトル測定により評価を行った。さらに、小麦の種類による差異、小麦胚芽を抽出する際の有機溶媒処理の条件による相違、についても検討を行い、これらの検討結果を総合することでプロリンとグルタミン酸の側鎖における選択的標識化技術を完成した。

为了高通量阐明蛋白质结构-功能关系，有必要建立一种大规模制备均质蛋白质的方法。迄今为止，我们已经利用小麦胚芽提取物的无细胞蛋白质合成系统建立了保留生理活性的大规模蛋白质表达系统，并开发了脯氨酸以外的蛋白质的氨基酸选择性稳定同位素标记技术。 19种氨基酸。另一方面，已知许多植物具有在脯氨酸和谷氨酸之间进行相互转化的系统。这些系统的存在对基于^1H-^<15>N HSQC谱分配的蛋白质主链结构信息分析影响不大，但我们认为通过^<13>C标记对侧链的分析有一定的影响。影响不大我们预测这会对结构信息分析产生不可忽视的影响，并开发了一种有效阻止相互转换系统的方法。为了抑制在脯氨酸转化为谷氨酸中起作用的脯氨酸脱氢酶活性，使用通过亲水性取代基提高了溶解度的羟基喹啉衍生物，在不抑制蛋白质合成能力的浓度范围内评价抑制能力。。另一方面，在谷氨酸转化为脯氨酸的两种酶中，P5CR的活性受到高浓度二价离子如Mg^2+的抑制，但蛋白质合成受到高浓度镁离子的抑制因此，我们评估了鸟氨酸（0.37mM，50% 抑制）抑制另一种酶 P5CS 的有效性。两种途径均通过HNCO光谱法使用^ 13 C、^ 15 N双标记脯氨酸和除脯氨酸之外的^ 15 N单标记氨基酸进行评价。此外，我们还研究了小麦种类和提取麦芽时有机溶剂处理条件的差异，并通过整合这些研究结果，我们开发了脯氨酸和谷氨酸侧链的选择性标记技术。

项目成果

期刊论文数量（12）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Nature of the chemical bond formed with the structural metal ion at the A9/G10.1 motif derived from hammerhead ribozymes.

与源自锤头核酶的 A9/G10.1 基序上的结构金属离子形成的化学键的性质。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
J.Am.Chem.Soc. 126
影响因子：
0
作者：
Y.Tanaka;T.Kasai;S.Mochizuki;A.Wakisaka;E.H.Morita;C.Kojima;A.Toyozawa;Y.Kondo;M.Taki
通讯作者：
M.Taki

Identification and characterization of NuhA, a novel Nudix hyrolase specific for ADP-ribose in the cyanobacterium Synechococcus sp.PCC7002.

NuhA 的鉴定和表征，NuhA 是一种新型 Nudix 水解酶，对蓝藻聚球藻 sp.PCC7002 中的 ADP-核糖具有特异性。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Biochim.Biophys.Acta 1699
影响因子：
0
作者：
K.Okuda;Y.Nishiyama;E.H.Morita;H.Hayashi
通讯作者：
H.Hayashi

Domain structures and characterization of an RNA binding proteins TLS/FUS.

RNA 结合蛋白 TLS/FUS 的结构域结构和表征。

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
J.Biol.Chem. 279
影响因子：
0
作者：
Y.Iko;T.S.Kodama;N.Kasai;T.Oyama;E.H.Morita;T.Muto;M.Okumura;R.Fujii;T.Takumi;S.Tate;K.Morikawa
通讯作者：
K.Morikawa

Characterizatio of RNA-binding properties of three types of Rbp proteins in Anabaena sp.PCC7120.

鱼腥藻 PCC7120 中三种 Rbp 蛋白的 RNA 结合特性的表征。