テロメア結合タンパク質によるシロイヌナズナの葉の老化誘導機構の構造科学的解析

端粒结合蛋白诱导拟南芥叶片衰老机制的结构科学分析

基本信息

批准号：
13014215
负责人：
森田勇人
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

シロイヌナズナのAtTRPは、第5染色体上に1コピーだけ存在するテロメア結合タンパク質で、Myb様のDNA結合モチーフを持ち、植物に存在するいくつかのイニシエーター結合タンパク質との類似性を持つ。AtTRPのMyb様領域はタンパク質全体のC末端側の領域に存在し、ゲルシフト実験の結果より、Myb様領域単独(55アミノ酸残基)ではテロメアリピートに対する結合親和性が低く、Myb領域の後ろのC末側領域(58アミノ酸残基)が存在して初めてテロメアリピートに対する選択的結合親和性が確認された。本研究では、部分的に欠損したC末領域を持つMyb様領域の作製を行い、ゲルシフト実験ならびに多次元NMR分光法による立体構造解析を行うことで、Myb様領域に続くC末側の領域がテロメア領域認識において果たす機能を解明することを目的とした。AtTRPのMyb様領域と完全長のC末領域を含むタンパク質は、大腸菌による大量発現系で可溶性画分として作製できたが、部分的に欠損したC末領域を持つMyb様領域は殆どが不溶性画分として回収され、変性剤による再生効率も低かった。そこで、タンパク質のフォールディングのタイミングが大腸菌と異なるコムギ胚芽の抽出物を用いた無細胞合成系を使用して大量発現を試みた。その結果、Myb様領域と完全長もしくは欠損したC末領域を持つタンパク質の殆ど全てを可溶性画分して回収することに成功した。さらに、この無細胞合成系では、約300μlの反応系で15nmol以上蛋白質が合成され、発現されたタンパク質にのみ特異的にラベルアミノ酸の取り込みが行われた。従って、全く精製を行わない試料溶液を用いて、発現したタンパク質の^1H-^<15>N HSQCスペクトルを測定することに成功した。現在、ゲルシフト実験を行うことでテロメアリピートの選択的認識に必須のC末領域の特定、ならびに^<15>N、^<13>Cの選択的二重標識体を作製し完全長のC末領域を持つMyb様領域の溶液構造解析を進めている。

拟南芥ATTRP是一种端粒结合蛋白，仅在5号染色体上的副本，具有类似Myb的DNA结合基序，并且与植物中存在的几种引发剂结合蛋白相似。 ATTRP的类似Myb样区域存在于整个蛋白质的C末端区域，并且从凝胶转移实验中，单独的MYB样区域（55个氨基酸残基）（55个氨基酸残基）的结合亲和力较低，并且仅在Myb armino Siginal Searderains Beark Serecruese（55个氨基酸残基）和端粒酶重复的选择性结合亲和力（58 Amino Amino Presenue are Bearly）。在这项研究中，我们旨在阐明通过创建具有部分缺失C末端区域的MYB样区域的C端区域在端粒区域识别中发挥作用的功能，并通过多维NMR光谱进行了凝胶移位实验和三维结构分析。含有类似MYB的区域和ATTRP的全长C末端区域的蛋白质可以作为使用大肠杆菌的大表达系统中的可溶性分数产生，但是大多数MYB样区域（Myb样区域）具有部分缺陷的C端区域，作为不溶性分数的部分有缺陷，并且具有不溶性的分数，并且具有Newating Agent的再生效率也很低。因此，我们尝试使用小麦菌提取物使用无细胞的合成系统来表达大量蛋白质，这些蛋白质在与大肠杆菌的蛋白质折叠时间上不同。结果，几乎所有具有MYB样区域以及全长或缺陷C末端区域的蛋白质在可溶性部分中成功回收。此外，在这个无细胞的合成系统中，在约300μl的反应系统中合成了15 nmol或更多的蛋白质，并且仅将标记的氨基酸专门掺入表达的蛋白质中。因此，我们能够使用根本没有纯化的样品溶液成功地测量表达蛋白的 ^1H - ^<15> N HSQC光谱。当前，进行了凝胶移位实验，以识别C末端区域对于选择性识别端粒重复序列必不可少的，以及创建 ^<15> n和 ^<13> C的选择性双重标签，并分析具有全长C末端区域的MyB样区域的溶液结构。