藻類の低温環境適応におけるmRNAの構造転移を誘導する蛋白質の構造機能相関の解析

藻类适应低温环境过程中诱导mRNA结构转变的蛋白质结构与功能关系分析

基本信息

批准号：
12780498
负责人：
森田勇人
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ラン藻Anabaena variabilis M3株のRNA結合蛋白質RbpAlがRNA分子上に存在する局所的な相補領域間で二次構造を形成するのを防ぐ分子機構を構造科学的に解明することを目的とした。RbpAlは2つの機能単位RRMとグリシンリッチドメインから構成され、安定同位体標識法を併用した多次元NMR分光法によるこれまでの研究結果から、RRMは1枚のベータシートと2本のαヘリックス構造から構成されるのに対し、グリシンリッチドメインは溶液中では明確な二次構造をとらないことを明らかにした。そこで、グリシンリッチをほとんど欠損したRbpAlや部位特異的変異を導入したRbpA1を作製し、そのRNA結合活性と立体構造の相関について、円偏光二色性(CD)スペクトルを測定することで解析した。その結果、グリシンリッチドメインを完全に欠損したRbpAlはRNA結合活性を失うが2アミノ酸残基余分に残したRbpAlでは活性が保持されていた。一方、これらのCDスペクトルにはほとんど差が無かったことから、グリシンリッチドメインのアミノ末端側の領域は、RRMの全体構造の安定化ではなく、RNA分子と直接相互作用する部位の安定化に重要であることが解った。また、ベータシート構造のアミノ末端側のタイロシンやその側鎖の向きを決定していると考えられる46番目のフェニルアラニンに変異を導入しても、RNAの結合活性が大幅に低下したが、必ずしもRRMの二次構造が大きく変化するとは限らなかった。以上の結果から、RRMの二次構造を維持するのに重要なアミノ酸ならびにRRMがRNA分予を認識するのに重要なアミノ酸残基を同定し、RNA分子と相互作用するRRMの部位を推定した。

这项研究旨在阐明分子机制，其中RBPAL是蓝藻Anabaena variabilis m3的RNA结合蛋白，阻止了RNA分子上存在的局部互补区域之间二级结构的形成。先前使用稳定同位素标记的多维NMR光谱的研究表明，虽然RRM由一个β片和两个α-螺旋结构组成，但富含甘氨酸富域的溶液中没有明显的二级结构。因此，制备了引入位置定向突变的RBPAL，它几乎缺乏富含甘氨酸的RBPA，并通过测量圆形二色性（CD）频谱来分析其RNA结合活性与其构象之间的相关性。结果，RBPAL在富含甘氨酸的结构域中完全不足，失去了RNA结合活性，但是RBPAL保留了额外的2个氨基酸残基，保留了活性。另一方面，这些CD光谱几乎没有差异，并且发现富含甘氨酸的结构域的氨基末端区域对于稳定直接与RNA分子相互作用的位点很重要，而不是稳定RRM的整体结构。此外，即使将突变引入了第46位的苯丙氨酸中，这被认为可以确定β片结构的氨基末端及其侧链的泰糖苷的取向，但RNA的结合活性显着降低，但RRM的二级结构不一定发生了显着变化。从上述结果中，氨基酸对于维持RRM的二级结构以及RRM识别RNA级数很重要的氨基酸残基很重要，并且估计了与RNA分子相互作用的RRM位点。