藻類の低温環境適応におけるmRNAの構造転移を誘導する蛋白質の構造機能相関の解析

藻类适应低温环境过程中诱导mRNA结构转变的蛋白质结构与功能关系分析

基本信息

批准号：
12780498
负责人：
森田勇人
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ラン藻Anabaena variabilis M3株のRNA結合蛋白質RbpAlがRNA分子上に存在する局所的な相補領域間で二次構造を形成するのを防ぐ分子機構を構造科学的に解明することを目的とした。RbpAlは2つの機能単位RRMとグリシンリッチドメインから構成され、安定同位体標識法を併用した多次元NMR分光法によるこれまでの研究結果から、RRMは1枚のベータシートと2本のαヘリックス構造から構成されるのに対し、グリシンリッチドメインは溶液中では明確な二次構造をとらないことを明らかにした。そこで、グリシンリッチをほとんど欠損したRbpAlや部位特異的変異を導入したRbpA1を作製し、そのRNA結合活性と立体構造の相関について、円偏光二色性(CD)スペクトルを測定することで解析した。その結果、グリシンリッチドメインを完全に欠損したRbpAlはRNA結合活性を失うが2アミノ酸残基余分に残したRbpAlでは活性が保持されていた。一方、これらのCDスペクトルにはほとんど差が無かったことから、グリシンリッチドメインのアミノ末端側の領域は、RRMの全体構造の安定化ではなく、RNA分子と直接相互作用する部位の安定化に重要であることが解った。また、ベータシート構造のアミノ末端側のタイロシンやその側鎖の向きを決定していると考えられる46番目のフェニルアラニンに変異を導入しても、RNAの結合活性が大幅に低下したが、必ずしもRRMの二次構造が大きく変化するとは限らなかった。以上の結果から、RRMの二次構造を維持するのに重要なアミノ酸ならびにRRMがRNA分予を認識するのに重要なアミノ酸残基を同定し、RNA分子と相互作用するRRMの部位を推定した。

本研究的目的是利用结构科学阐明阻止蓝绿藻Anabaena variabilis菌株M3的RNA结合蛋白RbpAl在RNA分子上局部互补区域之间形成二级结构的分子机制等。 RbpAl由两个功能单元RRM和富含甘氨酸的结构域组成，之前使用多维NMR波谱结合稳定同位素标记的研究结果表明，RRM具有一个β折叠和两个α螺旋的结构，相比之下，甘氨酸。 -rich 结构域在溶液中不具有明显的二级结构。因此，我们创建了几乎没有甘氨酸丰富度的RbpA1或引入了位点特异性突变的RbpA1，并通过测量它们的圆二色性（CD）光谱来分析它们的RNA结合活性和三维结构之间的相关性。结果，缺乏富含甘氨酸结构域的RbpA1完全丧失了RNA结合活性，但具有两个额外氨基酸残基的RbpA1保留了其活性。另一方面，由于这些 CD 光谱之间几乎没有差异，富含甘氨酸的结构域的氨基末端区域对于稳定与 RNA 分子直接相互作用的位点非常重要，而不是稳定 RRM 的整体结构。事实证明确实如此。此外，即使在β-折叠结构的氨基末端一侧的泰乐菌素和被认为决定其侧链方向的46位苯丙氨酸中引入突变，RNA结合活性也显着降低，但RRM的二级结构不一定发生显着变化。基于上述结果，我们鉴定了维持RRM二级结构的重要氨基酸和RRM识别RNA分裂的重要氨基酸残基，并估计了RRM与RNA分子相互作用的位点。