遺伝子ノックアウトを用いた新規クラスE分子群による小胞輸送の研究

利用基因敲除研究新型 E 类分子的囊泡运输

基本信息

批准号：
16044203
负责人：
田中伸幸
金额：
$ 3.97万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

エスコートに分類される輸送関連Hrsの機能解析を行う目的で、ノックアウトマウスからHrs欠損マウス由来不死化細胞株を樹立した。EGF受容体の分解と細胞内コンパートメント動態を検討した。cycloheximide存在下においてタンパク分解の時間経過を観察したところ、Hrs欠損細胞において受容体分解が有意に遅延しシグナル伝達の継続時間の延長が認められた。HrsはIL-2によりSTATと同様にチロシンリン酸化を受ける蛋白であることから、サイトカイン受容体と小胞輸送を結びつける分子群であることが予想された。Hrsノックアウト細胞およびSTAM1/STAM2ダブルノックアウト線維芽細胞株をIL-6で刺激したところ、STAT3活性化が長時間持続した。gp130はIL-6非依存性の状態においてプロテアソームおよびライソソーム系による分解を受けるが、IL-6刺激後の挙動はライソソーム系による分解が主であった。Hrsはgp130のライソソーム依存性分解を制御していた。IL-6刺激後のgp130の細胞内トラフィック動態を検討したところ、IL-6刺激後早期にインターナライズされ早期エンドソーム(EE)に輸送され、STAMs/Hrs複合体と一過性に共局在した。STAM/Hrsはユビキチン結合性ドメイン(UIM,VHS)を持ちユビキチン化蛋白(Cargo)を認識することからgp130のユビキチン化を検討したところポリユビキチン化・モノユビキチン化の両者からなる修飾を受けていた。したがってSTAMs・Hrs複合体はEE経由のgp130分解に関与し、最終的にリソソーム依存性受容体分解とシグナル停止に関与していた。

为了对归类为伴游的运输相关的HR进行功能分析，从敲除小鼠中建立了来自HRS缺陷小鼠的永生细胞系。研究了EGF受体和细胞内室内动力学的降解。当在存在环己酰亚胺的情况下观察到蛋白水解的时间过程时，HRS缺陷细胞中受体降解显着延迟，并且信号传导的持续时间延长。由于HRS是一种经历与IL-2相似的酪氨酸磷酸化的蛋白质，因此预计它是将细胞因子受体和囊泡转运联系起来的一组分子。刺激HRS基因敲除细胞和stam1/stam2双基因敲除成成纤维细胞系具有IL-6的允许持续的STAT3激活。 GP130在IL-6独立的状态下，蛋白酶体和溶酶体系统的降解，但是IL-6刺激后的行为主要是溶酶体系统降解。 HRS调节GP130的溶酶体依赖性降解。当我们研究IL-6刺激后GP130的细胞内交通动力学时，它在IL-6刺激后早期内化并转运到早期内体（EE），并与Stams/HRS复合物暂时共定位。 StAM/HRS具有泛素结合结构域（UIM，VHS）并识别泛素化蛋白（货物），因此研究了GP130的泛素化，并通过多泛素化和单次泛素化进行了修改。因此，StAMS-HRS复合物通过EE参与GP130降解，并最终参与溶酶体依赖性受体降解和信号停滞。