脳リンクプロテインによる脳実質コンドロイチン硫酸プロテオグリカン複合体の機能制御

脑连接蛋白对脑实质硫酸软骨素蛋白多糖复合物的功能调节

基本信息

批准号：
15040215
负责人：
大橋俊孝
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

1.Bral1/Hapln2ノックアウトマウス解析:ランビエ絞輪外マトリックス分子は傍絞輪形成やNaチャンネルのクラスター化には影響を与えないが、絞輪外のマトリックス環境には大きな変化をもたらす。これらの形成分子はランビエ絞輪外に局在するヒアルロン酸に依存するものであり、それをさらに安定化するものとしてBral1/Hapln2が重要な役割をはたす。2.Hapln3/Lp3の脳実質での発現解析:Haplnの中で発現解析の最も遅れていたHapln3について、特異的抗体作製を行い、その抗体を用いてマウス成体脳での発現解析を行った。脳実質での発現は認められないが、ある程度の大きさの動静脈の平滑筋周囲にversicanと共発現しているものである。脳実質瘢痕形成時などの病態での発現は不明であるが、この結果、正常マウス成体脳実質での主なHapln遺伝子はHapln2,Hapln4となる。3.Bral2/Hapln4ノックアウトマウス作製:前年度までに行った我々の実験からBral2/Hapln4は神経特異的で、神経細胞周膜とよばれるマトリックスを構成する分子の1つであることが明らかとなった。本年度の研究計画としてBral2/Hapln4ノックアウトES細胞の樹立とノックアウトマウス個体の作製を目標とした。ES細胞の樹立、キメラマウス個体の作製は順調に行われたが、野生型マウスとの交配による、生殖系列マウスの作製に時間をとり、なかなか生殖系列の完成が成功しなかった。現在、交配による複数の♀からF1世代マウスが出産したところである。+/-マウスの存在がこの中に期待される。4.マウス以外のHapln遺伝子解析モデル動物解析について:前年度我々は、発生期におけるHapln遺伝子および関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子の機能解析モデルとして、ゼブラフィッシュを用い遺伝子クローニングと発現解析、遺伝子停止(ノックダウン)実験をversican, dermacan, aggrecanを題材に行った。さらに、今年度はHapln1/Crtl1遺伝子クローニングと発現解析をおこない、Hapln1/Crtl1遺伝子はマウス等と同様に胎生期脳に発現していることを確認した。ゼブラフィッシュの特色を生かしたモデル動物になりうることを試行した。具体的には、モルフォリノによるノックダウンのほかに、トランスジェニックフィッシュ作製が有効手段となることを確認した。以上のように、いくつかの遺伝子学的手法により、脳に発現するHapln遺伝子の機能解析が進んだ。

1、Bral1/Hapln2敲除小鼠分析：Ranvier环外基质分子不影响近环的形成或Na通道的聚集，但会带来环外基质环境的显着变化。这些形成的分子依赖于朗飞环外的透明质酸，而 Bral1/Hapln2 在进一步稳定它方面发挥着重要作用。 2. Hapln3/Lp3在脑实质中的表达分析：我们生成了针对Hapln3的特异性抗体，这是分析最不充分的Hapln，并使用该抗体分析了其在成年小鼠大脑中的表达。尽管在脑实质中未观察到表达，但其与一定大小的动静脉平滑肌周围的多功能蛋白聚糖共表达。尽管在脑实质疤痕形成等病理条件下的表达尚不清楚，因此，正常小鼠成年脑实质中主要的Hapln基因是Hapln2和Hapln4。 3.Bral2/Hapln4敲除小鼠的创建：我们截至前一年进行的实验表明，Bral2/Hapln4是神经特异性的，并且是构成称为神经元周质Ta的基质的分子之一。今年的研究计划旨在建立Bral2/Hapln4敲除ES细胞并产生敲除小鼠。虽然ES细胞的建立和嵌合体小鼠个体的产生都很顺利，但通过与野生型小鼠杂交来创建种系小鼠需要时间，并且很难成功完成种系。目前，F1代小鼠是由多只雌性通过交配产生的。预计+/-小鼠的存在。 4.除小鼠以外的Hapln基因分析模型关于动物分析：去年，我们使用斑马鱼作为发育期的Hapln基因及相关硫酸软骨素蛋白多糖基因的功能分析模型，进行了基因克隆、表达分析和基因终止（击倒））使用 versican、dermacan 和 aggrecan 作为受试者进行实验。此外，今年我们进行了Hapln1/Crtl1基因克隆和表达分析，证实Hapln1/Crtl1基因在胚胎脑中表达，与小鼠相似。我们尝试了利用斑马鱼作为模型动物的可能性，利用其特征。具体来说，除了使用吗啉进行敲除之外，我们还证实了创建转基因鱼是一种有效的方法。如上所述，几种遗传技术已经推进了大脑中表达的 Hapln 基因的功能分析。