アラビドプシス変異株を用いた左右性決定機構の解明

利用拟南芥突变体阐明左右决定机制

• 批准号: 14036225
• 负责人: 橋本 隆
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14036225/
• 关键词: 左右性; ねじれ; 微小管; アラビドプシス; チューブリン; 微小管付随タンパク質

1.SPRタンパク質の細胞内局在性をGFP融合タンパク質を用いて調べた。SPR1-GFP及びSPR2-GFPを35S又は自身のプロモーターで発現させたところ、それぞれの変異株を相補したので、融合タンパク質は機能することが判った。SPR1とSPR2共にGFP蛍光は表層微小管に局在した。2.大腸菌で発現、精製したSPR1及びSPR2がタバコBY2細胞から精製した微小管に結合するかどうか調べたところ、SPR2は結合したが、SPR1単独では結合活性は見られなかった。SPR2の微小管への結合親和性は一般に知られている微小管付随タンパク質(MAP)の結合親和性と同程度であり、SPR2一分子に対してチューブリン二量体が3から4分子結合すると計算された。3.アラビドプシスゲノムには5つのSPR1ホモログ(SP1L1〜SP1L5)、1つのSPR2ホモログ(SP2L)があるが、これらのホモログをそれぞれspr1又はspr2で強制発現させたところ、ねじれ変異形質が相補された。従って、これらSPRホモログはSPR機能を持っていると考えられる。現在、これらホモログのknock-out変異株を取得し、それぞれspr1又はspr2と二重及び多重変異株を作製している。4.新たに6種類の左巻き変異株を単離し、解析したところ、全てチューブリン二量体のinter-dimer又はintra-dimer部位のアミノ酸変異であった。5.lefty型変異チューブリンをタバコBY2培養細胞で発現させた。現在、発現細胞系統からチューブリンの単離・精製を試みている。

1。使用GFP融合蛋白研究了SPR蛋白的亚细胞定位。 SPR1-GFP和SPR2-GFP用35s或其自己的启动子表达，并且发现融合蛋白起作用，因为相应的突变体得到了补充。 SPR1和SPR2的GFP荧光均位于表面微管上。 2。检查它是否在大肠杆菌中表达和纯化的Spr1和Spr2是否与从烟草BY2细胞纯化的微管结合，SPR2结合，但单独使用SPR1发现没有结合活性。 SPR2与微管的结合亲和力与常见的微管相关蛋白（MAP）的结合亲和力相当，并被计算为将三到四个小管蛋白二聚体与一个SPR2分子结合。 3。有五个SPR1同源物（SP1L1至SP1L5）和一个SPR2同源物（SP2L），当这些同源物分别被SPR1或SPR2表达时，扭转突变特性得到补充。因此，这些SPR同源物被认为具有SPR功能。当前，已经获得了这些同源物的敲除突变菌株，并且分别用SPR1或SPR2产生了双重突变菌株。 4。分离并分析了六个新的左手突变体，发现它们都是微管蛋白二聚体的二聚体或二聚体内二聚体或二聚体内的氨基酸突变。 5。左撇子突变小管蛋白在烟草BY2培养细胞中表达。当前，我们正在尝试将小管蛋白隔离到表达细胞系中。

项目成果

S.Thitamadee et al.: "Microtubule basis for left-handed helical growth in Arabidopsis"Nature. 417. 193-196 (2002)

S.Thitamadee 等人：“拟南芥左手螺旋生长的微管基础”自然。

T.Hashimoto: "Molecular genetic analysis of left-right handedness in plants"Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 357. 799-808 (2002)

T.Hashimoto：“植物左右手性的分子遗传学分析”Phil。