哺乳動物CPEBホモログによるmRNA情報の時空間的発現制御機構の解析

哺乳动物CPEB同源物mRNA信息时空表达调控机制分析

• 批准号: 14035203
• 负责人: 柏原 真一
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14035203/
• 关键词: 精子形成; ポリ(A)ポリメラーゼ; CPEB; 細胞質ポリアデニル化反応; 転写後調節; 遺伝子発現制御; ノックアウトマウス

哺乳動物雄性生殖細胞細胞質特異的に存在するポリ(A)ポリメラーゼTPAPは,精子形態形成に必須である。しかしながら,その標的mRNAやポリ(A)鎖伸長機構については不明な点が多い。申請者は,卵形成過程における母性mRNAの細胞質でのポリ(A)鎖伸長を制御するシス配列であるCPE配列(cytoplasmic polyadenylation element, UUUUU/AAU)とその結合タンパク質CPEBあるいはそのホモログが,TPAPによる球状精細胞特異的なポリ(A)鎖伸長に関与しているのではないかと考え解析を行っている。これまでに同定されているTPAPの標的mRNAは,基本転写関連因子であるTrf2やTFIIAγおよびTAF10などであり,それらの3'非翻訳領域(3'UTR)中にはCPE様配列が存在した。そこでCPE配列をセンスプライマーに用いた3'RACE法により,CPE配列を有するmRNAのいくつかをマウス精巣cDNAライブラリーよりクローニングした。それぞれについて,野生型とTPAP欠損マウス精巣でのmRNAサイズを比較した結果,Nut2などいくつかの転写関連因子がTPAPの標的mRNAであることが明らかとなり,CPE様配列がシス制御配列の一つであることが支持された。しかしながら,CPE様配列を有していてもポリ(A)鎖伸長を受けないものも存在することから,CPE配列は必要条件の一つではあるが,十分条件ではないことが示唆された。一方,CPEBの標的mRNAであるSCP1とSCP3のmRNAのポリ(A)鎖長は,TPAP欠損マウスのパキテン期精母細胞でも野生型と同じであることや,CPEBとTPAPの発現時期は同調していないことから,CPEBはTPAPによるポリ(A)鎖伸長には関与していないことが推測された。そこで,データベース上に存在するほかの3つのCPEBホモログについて発現解析を行った結果,そのうちの一つが精巣で高発現しており,かつTPAPの発現と同調していた。このCPEBホモログに対する特異的抗体が得られたので,タンパク質レベルでの発現・局在を明らかにするとともに,免疫沈降されるmRNAの同定を行うことにより,TPAPによる球状精細胞特異的なポリ(A)鎖伸長への関与について検討している。今後はこのCPEBホモログの解析を進めるとともに,標的mRNAの3'UTRに結合するような制御因子の探索・同定を行うことにより,TPAPによる球状精細胞細胞質特異的な特定のmRNAのポリ(A)鎖伸長制御機構についてさらに解析していく予定である。

Poly(A) 聚合酶 TPAP 特异存在于哺乳动物雄性生殖细胞的细胞质中，对于精子形态发生至关重要。然而，关于靶标 mRNA 和 Poly(A) 链延长机制尚有许多未知数。申请人提出，CPE序列(胞质多腺苷酸化元件，UUUUU/AAU)是在卵子发生过程中控制母体mRNA细胞质中多聚(A)链伸长的顺式序列，及其结合蛋白CPEB或其同源物，我们正在基于以下假设进行分析：TPAP 可能参与球状精子细胞特有的聚 (A) 链延长。目前已鉴定的TPAP靶mRNA包括Trf2、TFIIAγ、TAF10等基本转录相关因子，其3'非翻译区（3'UTR）中存在CPE样序列。因此，使用CPE序列作为有义引物，使用3'RACE方法从小鼠睾丸cDNA文库克隆一些含有CPE序列的mRNA。通过比较野生型和 TPAP 缺陷型小鼠睾丸的 mRNA 大小，发现几种转录相关因子（例如 Nut2）是 TPAP 的靶 mRNA，而 CPE 样序列是顺式-支持一件事。然而，有些物种即使具有类似CPE的序列，也不会发生poly(A)链延长，这表明虽然CPE序列是必要条件，但它不是充分条件。另一方面，TPAP缺陷小鼠的粗线期精母细胞中作为CPEB的靶mRNA的SCP1和SCP3 mRNA的poly(A)链长度与野生型相同，并且CPEB和SCP3的表达时间相同。 TPAP 是同步的，这表明 CPEB 不参与 TPAP 的聚 (A) 链延长。因此，我们分析了数据库中其他三个CPEB同源物的表达，发现其中一个在睾丸中高表达，并且与TPAP的表达同步。现在我们已经获得了针对该 CPEB 同源物的特异性抗体，我们将在蛋白质水平上阐明其表达和定位并鉴定免疫沉淀的 mRNA）我们正在研究其在链延长中的作用。未来，我们将继续分析该CPEB同源物，寻找并鉴定与靶mRNA 3'UTR结合的调控因子，并计划进一步分析其链延伸控制机制。

项目成果

Kashiwabara, S. (他10名): "Regulation of spermatogenesis by testis-specific, cytoplasmic poly(A) polymerase TPAP"Science. 298・5600. 1999-2002 (2002)

Kashiwabara, S.（其他 10 人）：“睾丸特异性细胞质多聚腺苷酸聚合酶 TPAP 对精子发生的调节”《科学》298·5600（2002 年）。

Sugiura, S., Kashiwabara, S., Iwase, S., Baba, T: "Expression of a testis-specific form of TBP-related factor 2(TRF2)mRNA during mouse spermatogenesis"Journal of Reproduction and Development. 49・1. 107-111 (2003)

Sugiura, S.、Kashiwabara, S.、Iwase, S.、Baba, T：“小鼠精子发生过程中睾丸特异性形式的 TBP 相关因子 2(TRF2)mRNA 的表达”生殖与发育杂志 49・1。 .107-111 (2003)

Takahashi, Y., Kako, K., Kashiwabara, S.(他8名): "Mammalian copper chaperone Cox17p has an essential role in activation of cytochrome c oxidase and embryonic development"Molecular and Cellular Biology. 22・21. 7614-7621 (2002)

Takahashi, Y.、Kako, K.、Kashiwabara, S.（以及其他 8 人）：“哺乳动物铜伴侣 Cox17p 在细胞色素 C 氧化酶的激活和胚胎发育中具有重要作用”《分子与细胞生物学》22・21。 7621 (2002)

Baba, D., Kashiwabara, S.(他6名): "Mouse sperm lacking cell surface hyaluronidase PH-20 can pass through the layer of cumulus cells and fertilize the egg"Journal of Biological Chemistry. 277・33. 30310-30314 (2002)

Baba, D.、Kashiwabara, S.（其他 6 人）：“缺乏细胞表面透明质酸酶 PH-20 的小鼠精子可以穿过卵丘细胞层并使卵子受精”《生物化学杂志》277・33。 2002）

Nishimura, H., Kim, E., Fujimori, T., Kashiwabara, S.(他3名): "The ADAM1a and ADAM1b genes, instead of the ADAM1(fertilin α)gene, are localized on mouse chromosome 5"Gene. 291・1-2. 67-76 (2002)

Nishimura, H.、Kim, E.、Fujimori, T.、Kashiwabara, S.（以及其他 3 名）：“ADAM1a 和 ADAM1b 基因，而不是 ADAM1（生育素 α）基因，位于小鼠 5 号染色体上”基因291・1-2。