精細胞細胞質でのmRNAポリ(A)鎖伸長による遺伝子発現制御ネットワークの解析

精子细胞质中 mRNA 聚腺苷酸链延长分析基因表达控制网络

• 批准号: 15030203
• 负责人: 柏原 真一
• 金额: $ 4.1万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15030203/
• 关键词: 精子形成; ポリ(A)鎖; TPAP; RNA結合タンパク質; タンパク質輸送; モータータンパク質; トランスジェニックマウス; 細胞質ポリアデニル化反応; KIF2A; 精子形成; ポリ(A)鎖; TPAP; RNA結合タンパク質; タンパク質輸送; モータータンパク質; トランスジェニックマウス; 細胞質ポリアデニル化反応; KIF2A

哺乳動物精巣に特異的なポリ(A)ポリメラーゼTPAPの欠損マウスでは,精子核や鞭毛などの形態形成にかかわる遺伝子の転写量が著しく低下しており,結果として精子形成が球状精細胞の段階で停止する。今年度は,昨年度に引き続きTPAP欠損による精子形成不全の分子基盤について検討した。(1)TPAPによるmRNAポリ(A)鎖伸長機構の解析…TPAPはパキテン期精母細胞から存在するが,特定mRNAに対するポリ(A)鎖伸長は球状精細胞特異的である。そのmRNA特異性や時期特異性を決定する機構について検討した。標的mRNAであるTRF2とTFIIAγの3'-非翻訳領域(UTR)を用いたEMSA法による競争阻害実験により,同一の因子が結合していると考えられた。TFIIAγとTRF2の3'-UTR中にはそれぞれ3つと1つのcytoplasmic polyadenylation element(CPE, UUUUU/AAU)が存在し,その結合タンパク質CPEB1には3つのパラログが存在する。CPEB2が精巣において高発現していることから,CPEB2がポリ(A)鎖伸長に関与していることが推測された。(2)精巣におけるTAF10の核移行機構の解析…抗TAF10抗体を用いた精巣抽出液の免疫沈降により,神経細胞形成に関わるモータータンパク質KIF2AのスプライシングバリアントであるKIF2βとKIF2γが共免疫沈降されたが,GST-pull downアッセイの結果,両者は直接相互作用しているのではないことが判明した。また,RT-PCRと免疫沈降によりスプライシングバリアントのうち,KIF2γのみが精巣においてTAF10の細胞内輸送に関わっていることが判明した。今後,両者を仲介するタンパク質を探索する予定である。(3)TPAP欠損マウスのプロテオーム解析…TPAP欠損マウスの球状精細胞では,TAF10以外にも影響を受けているタンパク質が存在する可能性がある。そこで,野生型とTPAP欠損マウスの精巣タンパク質を二次元電気泳動により比較したところ,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではSorbitol dehydrogenaseとAdenylate kinaseが減少していた。事実,TPAP欠損マウスの球状精細胞ではこれらmRNAのポリ(A)鎖伸長が不完全であった。これらのことから,いくつかのmRNAの球状精細胞における正常な翻訳にはポリ(A)鎖の伸長が不可欠であることが示唆された。

在缺乏特定于哺乳动物睾丸的聚（A）聚合酶TPAP的小鼠中，诸如形态发生的基因的转录含量量（例如精子核和鞭毛）显着降低，导致在球体精子阶段停止精子发生。今年，我们继续研究去年TPAP缺乏引起的精子发生功能障碍的分子基础。 （1）通过TPAP进行的mRNA poly（A）链延伸机制[TPAP ... TPAP存在于Pachytene精子细胞中，但是特定mRNA的poly（a）链延伸是特定于球状精子细胞的。研究了确定mRNA特异性和定时特异性的机制。人们认为相同的因素是由涉及目标mRNA TRF2和TFIIAγ的3'-非翻译区域（UTR）的EMSA方法约束的。 TFIIAγ和TRF2的3'-UTR分别存在三个和一个细胞质聚腺苷酸化元件（CPE，UUUUU/AAU），并且结合蛋白CPEB1中存在三个旁系同源物。睾丸中高度表达的CPEB2表明CPEB2参与聚（a）链延伸。 （2）分析TAF10在睾丸中的核易位机制...使用抗TAF10抗体对睾丸提取物进行免疫沉淀，导致KIF2A运动蛋白涉及神经元形成的剪接变体的共免疫沉淀，但GST-PULL降低了两种分析表明，两种蛋白质没有直接相互作用。此外，RT-PCR和免疫沉淀显示，仅剪接变体的KIF2γ参与睾丸中TAF10的细胞内转运。将来，我们计划寻找介导两者的蛋白质。 （3）TPAP缺陷小鼠的蛋白质组学分析...在TPAP缺陷型小鼠的球状精子中，除TAF10以外，还可能还有其他受影响的蛋白质。因此，当通过二维电泳比较野生型和TPAP缺陷型小鼠的睾丸蛋白时，在TPAP缺陷型小鼠的球状精子中降低了山梨糖醇脱氢酶和腺苷酸激酶。实际上，这些mRNA的聚（a）链延伸在TPAP缺陷小鼠的球状精子细胞中不完整。这些结果表明，聚（a）链延伸对于球状精子细胞中某些mRNA的正常翻译至关重要。